https://scholar.dgist.ac.kr/handle/20.500.11750/268 2026-04-09T13:21:21Z https://scholar.dgist.ac.kr/handle/20.500.11750/59758 Title: Insights of GPCR Signaling Events Revealed by Molecular Dynamics Simulation Author(s): Ashim Janbolat Abstract: G 단백질 연결 수용체(GPCRs)는 진핵생물에서 가장 큰 막단백질 그룹으로, G 단백질 및 β arrestin 을 매개로 다양한 세포외 신호를 세포 내 반응으로 전달하는 역할을 수행한다. G 단백질의 활성화는 Gα 소단위체로부터의 GDP 방출로 시작된다. 이는 Ras-유사 도메인과 나선 도메인 간의 분리를 포함하는 구조적 변화가 수반된다. GDP 결합 부위 주변의 구조적 특징은 광범위하게 연구되었으나, 도메인 사이의 경첩 부위(Linker 1)의 알로스테릭 역할은 상대적으로 잘 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 Gαi1 및 Gαs 동형체를 대상으로 래칫 분자동역학(ratcheted molecular dynamics)과 엄브렐러 샘플링(umbrella sampling) 시뮬레이션을 활용하여 경첩 길이가 GDP 방출 속도에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 긴 경첩을 가진 경우 GDP 방출이 촉진되며 이는 평균력장(PMF) 기반 자유에너지 프로파일 감소와 일치하는 반면, 짧은 경첩은 높은 에너지 장벽과 느린 뉴클레오타이드 교환과 관련됨을 확인하였다. 또한 Gαi3 에 대해 원자 수준의 분자동역학 시뮬레이션과 MM-PBSA 자유에너지 계산을 통해 GDP 결합 포켓 주변의 보존된 잔기들의 기여를 평가하였다. F336A, N269A, D272A, Y320A/H322A, S44A/K46A/S47A 돌연변이들을 도입하여 GDP/GTP 전환율, 구조적 동역학 및 GDP 결합 친화도에 대한 영향을 분석하였다. 그 결과, 인산기 결합 부위에서의 동적인 구조 변화가 GDP 방출의 핵심 결정 요소임을 확인하였으며, 이는 G 단백질 활성화 메커니즘에서의 중요성을 부각시킨다. GPCR–arrestin 상호작용의 분자적 기전을 규명하기 위해, 바소프레신 수용체의 인산화된 C말단 펩타이드(V2Rpp)와 결합한 β-arrestin1 에 대한 계산 기반 분석이 수행되었다. K294 잔기는 V2Rpp 결합에 필수적인 요소로 확인되었으며, K292 및 H295 는 극성 중심의 안정화 및 핑거 루프 형성을 도와 β-arrestin 의 활성화에 중요한 구조적 역할을 수행함을 보여주었다. 이와 같은 결과는 G 단백질 활성화 및 β-arrestin 매개 신호전달 메커니즘에 대한 원자 수준의 통찰을 제공하며, 경첩 부위가 뉴클레오타이드 교환과 동형체 특이적 신호전달을 조절하는 보존된 요소임을 강조한다. 모든 계산 결과는 수소-중수소 교환 질량분석법(HDXMS), BODIPY-GTPγS 형광 기반 활성화 분석, 결합 친화도 측정 등을 통해 실험적으로 검증되었다.|G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of transmembrane proteins in eukaryotes, responsible for transducing a wide range of extracellular signals into intracellular responses through G proteins and β-arrestins. Activation of G proteins is initiated by the release of GDP from the Gα subunit, a process that involves conformational changes, particularly the separation of the Ras-like and helical domains. While structural features proximal to the GDP-binding site have been extensively studied, the allosteric role of the interdomain hinge region (Linker 1) remains less characterized. To address this, ratcheted molecular dynamics and umbrella sampling simulations were used to investigate the influence of hinge length on GDP release kinetics in Gαi1 and Gαs isoforms. The results indicate that longer hinge regions facilitate more rapid GDP release, corresponding to reduced binding free energy profiles derived from potential of mean force (PMF) calculations, whereas shorter hinges correlate with higher energetic barriers and slower nucleotide exchange. Additionally, the contribution of conserved residues surrounding the GDP-binding pocket was evaluated through all-atom molecular dynamics simulations and MM-PBSA free energy calculations in Gαi3. Point mutations (F336A, N269A, D272A, Y320A/H322A, S44A/K46A/S47A) were analyzed for their impact on GDP/GTP turnover, conformational dynamics, and GDP-binding affinity. The results highlight that dynamic alterations in the phosphate- binding region are critical determinants of GDP release, underscoring its essential role in G protein activation mechanisms. To investigate the molecular basis of GPCR–arrestin interactions, computational analyses were conducted on β-arrestin-1 in complex with the phosphorylated C-terminal tail peptide of the vasopressin receptor (V2Rpp). Residue K294 was identified as a critical determinant for V2Rpp engagement, while K292 and H295 were found to stabilize the polar core and support finger loop formation-structural features essential for arrestin activation. Together, these findings offer atomic-level insights into the mechanisms of G-protein activation and arrestin-mediated signaling, highlighting the hinge region as a conserved regulator of nucleotide exchange and isoform-specific signaling dynamics. All simulation results were supported by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS), BODIPY-GTPγS fluorescence assays, and binding affinity measurements. Keywords: G protein-coupled receptor, G protein, β-Arrestin, Phosphorylation, GDP, Conformational dynamics Description: G protein-coupled receptor, G protein, β-Arrestin, Phosphorylation, GDP, Conformational dynamics 2024-12-31T15:00:00Z https://scholar.dgist.ac.kr/handle/20.500.11750/59757 Title: Investigation of oxidative stress as a driver of early neurogenic lineage disruption in APPswe hiPSC-derived neural progenitor cells Author(s): Joonho Cho Abstract: 인간유도만능줄기세포에서 유래한 대뇌 오가노이드 기술은 인간과 유사한 환경으로 체외에서 알츠하이머병의 초기 세포변화에 대해 연구하는데 매우 유용한 모델이다. 본 연구에서는 APP Swedish (APPswe) 유전자를 보유한 대뇌 오가노이드를 활용하여 알츠하이머 질환 진행 과정 중 나타나는 조기 신경발생 이상 및 관련 분자 기전을 규명하고자 하였다. 한 달간 배양한 APPswe 대뇌 오가노이드는 신경 활동 증가 및 조기 신경분화 현상을 나타냈으며, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 유세포 분석을 통해 신경전구세포 표지의 감소와 미성숙 신경세포 표지의 증가가 관찰되었다. 이는 성숙한 신경세포로의 완전한 분화 없이 신경전구세포에서 미성숙 신경세포로의 비정상적인 분화를 나타내었다. 이차원 배양 환경에서는 APPswe 신경전구세포의 미토콘드리아 유래 활성산소종의 증가가 조기 신경분화를 유도하는 주요 원인임을 확인하였으며, 항산화제인 EUK8 처리는 이를 회복시켰다. 이 결과는 다른 알츠하이머 유전자인 APOE4 표현형을 가진 신경전구세포에서도 관찰되었으나 알츠하이머 관련 유전적 배경이 없는 경우에는 활성산소종의 증가만으로 신경세포로의 조기분화를 관찰하지는 못하였다. 전사체 분석 결과 APPswe 신경전구세포는 신경세포 발달, 시냅스 형성, 소포 수송 관련 유전자의 발현이 증가한 반면, 세포증식 관련 유전자들은 감소하였다. 이와 함께 스트레스 관련 유전자인 TFE3의 발현이 증가하였으며, 기저상태의 DNA손상 수준과 외부 스트레스에 대한 민감성도 증가하였다. 종합적으로, APPswe 돌연변이는 미토콘드리아 산화 스트레스를 통해 조기 신경전구세포의 분화를 교란시키며, 이는 AD 의 초기 병리 기전을 반영하는 중요한 현상임을 시사한다.본 연구는 알츠하이머병 조기 병리 기전에 대한 이해를 확장하였으며, 미토콘드리아 활성산소종이 조기 신경분화의 주요 조절자로 작용함을 제시하였다. 핵심어: 알츠하이머 병, 신경분화, 활성산소종, 인간유도만능줄기세포|Cerebral organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) provide a valuable platform to investigate human specific biological processes and early cellular events in Alzheimer’s disease (AD) under in vitro conditions. In this thesis, I utilized isogenic hiPSC derived cerebral organoids carrying the APP Swedish mutation (APPswe) to explore early neurogenic alterations and the underlying molecular mechanisms associated with AD progression. APPswe cerebral organoids cultured for one month exhibited enhanced neuronal activity and premature neuronal differentiation. Notably, this premature differentiation was observed not only in neurons but also at the neural progenitor cells (NPCs) stage. Immunohistochemistry, western blot, and flow cytometry analyses consistently indicated a shift from NPC identity toward an immature neuronal fate without progression into mature neuronal lineages. In a two-dimensional (2D) culture system, APPswe NPCs exhibited elevated levels of reactive oxygen species (ROS) and identified as a key contributor to premature neuronal differentiation. Treatment with EUK8, a synthetic antioxidant, rescued the early neurogenic phenotype in APPswe NPCs. Similar phenotype was also observed in NPCs carrying APOE4 allele. However, elevated ROS alone was insufficient to induce this phenotype in the absence of AD associated genetic background. Transcriptome analysis further demonstrated that APPswe NPCs exhibited increased neuronal program, synaptogenesis, and vesicle transport related genes and decreased cell proliferation related genes. These changes were accompanied by elevated expression of stress-associated transcription factors such as TFE3 and increased basal DNA damage and vulnerability to stress. Taken together, these findings demonstrate that the APPswe mutation disrupts early neural progenitor dynamics through a mitochondrial oxidative stress. This work expands our understanding of early AD pathology by identifying mitochondrial ROS as a key regulator of premature neurogenesis. Keywords: Alzheimer’s disease (AD), Neuronal differentiation, Reactive oxygen species (ROS), human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) Description: Alzheimer's disease, Cerebral Organoid 2024-12-31T15:00:00Z https://scholar.dgist.ac.kr/handle/20.500.11750/59756 Title: Molecular mechanism of TMEM16E scramblase activation inducing ligand-independent growth factor receptor signaling and macropinocytosis for membrane repair Author(s): Jung-Eun Kim Abstract: TMEM16E 단백질은 인간의 근육세포에 많이 발현하며 근위축증 (MMD3, LGMD2L)및 골형성이상 (GDD)과 관련이 있다. TMEM16E는 칼슘 의존적으로 작동하는 이온 채널 및 인지질 스크램블레이즈 단백질로, 세포막의 인지질 비대칭 조절에 중요하게 관여한다. 포스파티틸세린 (PS)의 외부 노출은 세포사멸뿐 아니라 세포막 손상 시 복구 신호로도 작용할 수 있다. TMEM16F는 이러한 복구 과정에 중요한 역할을 하며, TMEM16E 역시 유사한 기능이 있을 것으로 추정되고 있으나 TMEM16E를 통한 PS 노출이 구체적으로 어떠한 메커니즘을 통해 세포막 복구를 유도하는지는 아직 규명되지 않았다. 따라서 본 연구자는 TMEM16E 스크렘블레이즈의 활성이 세포막 복구를 야기하는 분자적 메커니즘을 규명하였다. 본 연구에서는 칼슘 의존성 인지질 스크램블레이즈인 TMEM16E가 세포 내 칼슘 증가에 따라 활성화되면, 세포막 외부로 노출된 PS가 Annexin V와 결합한 뒤 세포질로 내재화 되는 특이적인 현상을 관찰하였다. 위와 같은 현상은 거대음세포작용 억제제인 아밀로라이드에 의해 완전히 억제되었으며 이로 인해 TMEM16E 스크램블레이즈가 거대음세포작용을 유도함을 확인하였다. 또한, 공동면역침전을 통해 TMEM16E와 성장인자 수용체 (EGFR, PDGFR)가 직접적으로 결합하며, TMEM16E 스크램블레이즈가 리간드 비의존적 성장인자 수용체의 활성화를 유도함을 확인하였다. 이 과정은 PI3K 경로를 활성화시키며, 이러한 메커니즘을 통해 스크램블링 활성 동안 세포막 완전성이 거대음세포작용에 의해 안정적으로 조절됨을 관찰하였다. 따라서 TMEM16E 스크램블레이즈에 의해 야기되는 거대음세포작용이 세포막 복구에 기여할 수 있음을 규명하였다. TMEM16E의 돌연변이는 근육 및 골격계 이상과 관련이 있으며, 이는 체내 pH 환경과 에너지 대사에 영향을 줄 수 있다. 또한, 격렬한 운동은 근육의 일시적인 산성화를 유도할 수 있어, TMEM16E의 pH 의존적 조절 메커니즘을 규명하는 것은 중요하다. 따라서 본 연구자는 TMEM16E 스크램블레이즈 및 TMEM16E 매개 거대음세포작용이 세포 외 수소이온 농도 변화에 따라 조절되며, 이는 칼슘 클리어런스 경로에 관여하는 Ca2+/H+ exchanger를 통해 매개됨을 확인하였다. 산성 조건에서는 Ca2+/H+ exchanger활성이 증가함으로써 세포 내 칼슘이 빠르게 감소하여 TMEM16E의 활성이 억제되고, 따라서 거대음세포작용도 빠르게 중단되었다. 그러나 알칼리 조건에서는 Ca2+/H+ exchanger의 활성이 증가하여 고농도의 칼슘이 유지된다. 따라서 TMEM16E의 활성이 지속적으로 일어나게 됨으로써 거대음세포작용이 지속되었다. 특히, 산성 조건에서는 세포 내 칼슘이 빠르게 감소하고 거대음세포작용이 일시적으로 일어남으로써 스크램블레이즈 활성 동안 세포막 완전성이 완전히 유지되었다. 또한, TMEM16E 매개 거대음세포작용 동안 세포 분열 및 생존이 TMEM16E가 발현되지 않은 세포보다 증가하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, 본 연구는 TMEM16E 스크렘블레이즈 활성화가 리간드 비의존적 성장인자 수용체 신호 및 거대음세포작용을 야기함으로써 세포막 복구 및 세포 생존을 조절할 수 있는 분자기전을 제시한다. 또한 TMEM16E 매개 거대음세포작용이 세포 외 pH에 따라 조절될 수 있음을 보여줌으로써 병리생리학적 조건에서 TMEM16E 스크램블레이즈가 세포 생존을 위한 중요한 인자로 작용할 수 있음을 제시한다.|The calcium-dependent phospholipid scramblase TMEM16E mediates ion transport and lipid translocation across the plasma membrane. TMEM16E also contributes to protection of membrane structure by facilitating cellular repair signaling. My research reveals that TMEM16E activation promotes macropinocytosis, essential for maintaining plasma membrane integrity. This scramblase externalizes phosphatidylserine, typically linked to resting growth factor receptors. I demonstrate that TMEM16E can interact with and signal through growth factor receptors, including epidermal growth factor receptors, even without ligands. This interaction stimulates downstream phosphoinositide 3-kinase and facilitates macropinocytosis and internalization of annexin V bound to the membrane, a process sensitive to amiloride inhibition. Although TMEM16E is internalized during this process, it returns to the plasma membrane. TMEM16E-driven macropinocytosis is proposed to restore membrane integrity after perturbation, potentially explaining pathologies in conditions like muscular dystrophies, where TMEM16E functionality is compromised, highlighting its critical role in muscle cell survival. Various mutations of TMEM16E are related to muscular dystrophy and bone dysplasia, which can indirectly affect pH environments in the body by muscle damage, and energy metabolism. Therefore, understanding the pH-dependent molecular mechanism of TMEM16E is crucial, but it remains unclear. Here, I show the TMEM16E scramblase and TMEM16E-mediated macropinocytosis were regulated by extracellular protons via Ca2+ clearance pathways. In acidic conditions, TMEM16E scrambling activity and macropinocytosis rapidly stopped, and intracellular calcium quickly decreased to basal levels compared to physiological conditions. Conversely, under alkaline conditions, TMEM16E scrambling activity and macropinocytosis remained persistently active, and intracellular calcium levels were highly elevated. Interestingly, TMEM16E-mediated macropinocytosis modulated membrane integrity and cell viability under acidic conditions. I demonstrate that extracellular acidification enhances cell survival by promoting TMEM16E-mediated macropinocytosis. In summary, this study uncovers a molecular mechanism by which TMEM16E scramblase activation drives ligand-independent growth factor receptor signaling and macropinocytosis, thereby facilitating membrane repair and contributing to cell survival under stress conditions. Description: TMEM16E, phospholipid scramblase, macropinocytosis, membrane repair, extracellular protons|TMEM16E, 인지질 스크램블레이즈, 거대음세포작용, 세포막 복구, 세포 외 pH 2024-12-31T15:00:00Z https://scholar.dgist.ac.kr/handle/20.500.11750/59755 Title: A human telomerase reverse transcriptase-derived peptide GV1001 rescues neurodegeneration in a mouse model of Alzheimer disease Author(s): Younghwan Lee Description: GV1001, Alzheimer disease, microglia, bradykinin receptor 1, migration, phagocytosis, MTORC2 2024-12-31T15:00:00Z