Molecular Regulatory Mechanisms of DNA Damage- and Stress-induced Leaf Senescence in Arabidopsis

Abstract

본 학위논문에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 잎 노화에 영향을 미치는 DNA-단백질 교차결합(DNA-protein crosslink, DPC) 수리를 통한 유전체 안정성 유지 및 이를 기반으로 한 노화 조절 메커니즘과, 염 스트레스 반응 전사인자를 통한 노화 조절 메커니즘을 연구하였다. 본 연구는 유전체 안정성과 환경 스트레스 반응이 식물의 노화 조절에 기여하는 분자 기작을 규명하는 데 주안점을 두었다. 잎의 노화는 잎 발달 과정의 최종 단계로, 노화가 진행됨에 따라 잎의 광합성 능력이 점진적으로 저하되며, 식물의 생장기간 동안 축적된 영양분들이 분해되며 새로 발생하는 기관으로의 재분배된다. 이러한 과정은 호르몬 변화와 같은 내재된 유전 프로그램과 빛, 온도와 같은 외부 환경요인 간의 복합적 상호작용에 의해 정교하게 조절된다. 그러나 잎 노화를 조절하는 분자적 메커니즘은 그 중요성에도 불구하고 여전히 부분적으로만 밝혀져 있어 추가적인 연구가 필요하다. 모든 생명체는 생애 동안 내인성 및 외인성 스트레스 요인에 지속적으로 노출되며, 이는 심각한 DNA 손상을 초래할 수 있다. DNA 손상은 동물에서 노화 과정을 촉진하고 세포의 기능을 저하시키는 주요한 요인으로 인식되어 왔다. 특히 DNA-단백질 교차결합(DPC)은 DNA 복제 및 전사 과정을 방해하여 유전체 안정성을 저해하며, 다양한 생물에서 조기 노화를 유발하는 치명적인 손상 유형으로 알려져 있다. 그러나 DPC 의 생물학적 중요성과 잎 노화 조절에서의 역할은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 DPC 가 잎 노화에 과정에서 점진적으로 축적되며, 이러한 과도한 축적이 잎의 조기 노화를 유발한다는 사실을 입증하였다. 이는 미수선된 DPC 가 잎 노화를 유도하는 분자 신호로 기능할 가능성을 시사하며, DPC 수리 기작이 잎 수명 연장에 핵심적인 역할을 수행함을 보여주었다. DPC 수리가 잎 노화 조절에 기여하는 분자적 메커니즘을 규명하기 위해, 본 연구는 Zinc-metalloprotease 인 효모 Wss1 및 포유류 SPRTN 과 상동성을 가지는 애기장대 WSS1A 에 주목하였다. Wss1 및 SPRTN 단백질은 DPC 의 단백질 부분을 분해하여 유전체 안정성을 유지하는 데 중요한 기능을 수행한다고 알려져 있다. WSS1A 가 결핍된 돌연변이체에서는 자연 노화, 암 처리, cis-Pt 처리에 의한 조기 노화 관찰되었으며, 과발현 식물에서는 노화 현상이 지연되었다. 더불어 WSS1A 는 SUMO3 와 상호작용하며, 액체-액체 상분리(LLPS)를 통해 응집체를 형성하였다. 이는 SUMOylation 혹은 SIM 을 통한 WSS1A 과 SUMO3 간 비공유적 상호작용이 잎 노화 동안 DPC 수리에 중요한 역할을 할 가능성을 시사하였다. 또한 WSS1A 의 상분리 특성은 DPC 수리에 관여하는 단백질들의 국소적인 공간적 밀집화 및 생화학적 반응속도 향상에 기여할 수 있음을 보여주었다. 또한 잎 노화는 고온, 가뭄, 염 스트레스와 같은 다양한 환경 스트레스에 의해 조절된다. 특히 염 스트레스는 잎 노화를 가속화하는 대표적인 환경 요인으로 알려져 있다. 그러나 염 스트레스 신호와 잎 노화 프로그램의 통합 메커니즘은 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 APETALA2/ERF 전사인자 계열에 ERF34 가 염 스트레스 하에서 잎 노화를 조절하는 역할을 수행함을 규명하였다. ERF34 는 다양한 노화 유도 조건에서 차등적으로 발현되었으며, 나이, 암 스트레스 및 염 스트레스에 의해 유도된 잎 노화를 억제하였다. 또한 ERF34 는 종자 발아 및 영양생장 단계에서 염 스트레스 내성을 촉진하였다. 전사체 분석을 통해 ERF34 의 과발현이 염 스트레스 반응 관련 유전자(COR15A, ERD10, RD29A)의 발현을 유의미하게 증가시키는 것을 확인하였다. ERF34 는 ERD10 및 RD29A 의 프로모터에 직접 결합하여 전사를 활성화함으로써 염 스트레스 반응 경로를 강화하였다. 이러한 결과는 ERF34 가 염 스트레스 반응과 잎 노화 프로그램의 융합에 중요한 조절 인자로 기능하며, 염 스트레스 내성을 강화할 수 있는 작물 개량의 유망한 후보임을 시사하였다. 본 연구는 잎 노화 조절에서 유전체 안정성 유지 및 염 스트레스 반응의 분자 기작에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 이를 통해 식물 노화 과정에 대한 심층적 이해를 제시한다. 나아가 환경 스트레스 조건에서 작물 생산성과 내성을 향상시키기 위한 유전적 및 분자 생물학적 전략 수립에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.|Leaf senescence, the final stage of leaf development, is essential for plant fitness and nutrient recycling. It is regulated by a complex interplay of intrinsic genetic programs and environmental cues. Despite its biological importance, our knowledge of the regulatory mechanisms underlying leaf senescence is still fragmentary. All living organisms are inevitably exposed to various endogenous and environmental factors throughout their lifetimes, many of which can trigger potentially fatal DNA damage. DNA damage has been widely recognized as a primary driver of the aging process in animals, where it disrupts cellular homeostasis and accelerates a decline in cellular function. DNA-Protein Crosslinks (DPCs), one of the common types of DNA damage, are particularly harmful DNA lesions that obstruct essential processes such as replication and transcription, which threatens genome integrity and eventually leads to premature aging in diverse organisms including humans. However, the biological significance of DPCs and their repair in the control of leaf senescence remain poorly understood. In this study, I found that DPCs progressively accumulated during age-dependent leaf senescence, and their hyperaccumulation led to premature senescence. This finding suggests that unresolved DPCs act as molecular triggers for leaf senescence, emphasizing the importance of efficient DPC repair in extending leaf longevity. To understand the molecular mechanisms by which DPC repair contributes to the regulation of leaf senescence, I focused on WSS1A, an Arabidopsis metalloprotease orthologous to yeast Weak suppressor of smt3 (Wss1) and mammalian SPRTN. Both Wss1 and SPRTN are known to play essential roles in DPC repair by degrading the protein component of DPCs, thereby maintaining genome stability. Plants lacking WSS1A exhibited premature senescence, while its overexpression delayed senescence under both age-dependent and darkness-induced leaf senescence conditions. Furthermore, WSS1A interacted with SMALL UBIQUITIN MODIFIER 3 (SUMO3) and formed condensates via liquid-liquid phase separation (LLPS), indicating a potential role of SUMOylation in DPC repair during leaf senescence. WSS1A formed nuclear condensates via liquid-liquid phase separation (LLPS), which suggests that the phase separation behavior of WSS1A may facilitate the organization of DPC repair machinery. These findings implicate that SUMOylation and LLPS of WSS1A play roles in facilitating DPC repair during leaf senescence, probably through enhancing WSS1A’s function and organizing DPC repair machinery. As mentioned above, leaf senescence is regulated by diverse environmental stresses such as extreme temperature, drought, and salt stress. Salt stress is one of the most well-known environmental stresses that accelerate leaf senescence. However, the molecular mechanisms that integrate salt stress signaling with leaf senescence programs remain elusive. In this study, I characterized the role of ETHYLENE RESPONSIVE FACTOR34 (ERF3), a member of the APETALA2/ERF family, which modulates leaf senescence under salt stress. ERF34 was differentially expressed under various leaf senescence-inducing conditions, and negatively regulated leaf senescence induced by age, dark, and salt stress. ERF34 also promoted salt stress tolerance at different stages of the plant life cycle such as seed germination and vegetative growth. Transcriptome analysis revealed that the overexpression of ERF34 increased the transcript levels of salt stress-responsive genes including COLD-REGULATED15A (COR15A), EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION10 (ERD10), and RESPONSIVE TO DESICCATION29A (RD29A). Moreover, ERF34 directly bound to ERD10 and RD29A promoters and activated their expression. These findings indicate that ERF34 plays a key role in the convergence of the salt stress response with the leaf senescence programs, and is a potential candidate for crop improvement, particularly by enhancing salt stress tolerance. Together, this study provides novel insights into the molecular mechanisms of genome maintenance and salt-stress responses in regulating leaf senescence. These findings advance our understanding of plant senescence and provide promising strategies to improve crop productivity and stress tolerance under environmental stresses