Strategy development for comparing proximity labeling approaches in telomere interactome mapping

Abstract

텔로미어는 염색체 말단을 덮는 특수한 핵단백질 구조로, 쉘틴 복합체에 의해 유지됩니다. 하나의 구성 요소인 POT1은 단일 가닥 3′ 오버행에 결합하여 ATR 매개 DNA 손상 신호를 억제합니다. 인간 암의 약 10-15%에서 텔로미어 길이는 재조합 기반의 대체 텔로미어 연장(ALT) 경로를 통해 유지되며, 이 경로는 텔로미어와 ALT 관련 PML체에서 지속적인 DNA 손상을 특징으로 합니다. 따라서 텔로미어 상호작용체를 매핑하는 것은 정상 상태와 질병 상태에서 텔로미어 유지 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 근접 의존적인 바이오티닐화는 안정적인 상호작용체와 일시적인 상호작용체를 태그하여 이러한 네트워크를 현장에서 포착할 수 있습니다. 따라서 우리는 ALT 양성 U2OS 세포에서 두 개의 조작된 바이오티닌 리가제인 TurboID와 UltraID를 POT1에 융합하여 텔로미어 단백질체학 성능을 벤치마킹했습니다. 여기서 우리는 POT1–TurboID와 POT1–UltraID가 텔로미어에 국한되어 인접 단백질의 위치 특이적 바이오티닐화를 매개하지만, 뚜렷한 표지 프로파일을 가지고 있음을 보여줍니다. TurboID–POT1은 쉘틴 소단위체와 여러 DNA 복구 및 ALT 관련 인자의 완전한 보완을 회복하는 강력하고 광범위한 바이오티닐화 패턴을 제공합니다. UltraID–POT1은 배경이 감소된 보다 절제된 표지 프로파일을 생성하며, 이는 즉각적인 텔로미어 상호작용체에 대한 더 높은 특이성을 반영합니다. 이러한 발견은 표적 근접 표지가 ALT 텔로미어 프로테옴을 효과적으로 탐색할 수 있음을 보여줍니다. TurboID와 UltraID 태그를 비교함으로써, 우리는 프로테옴 커버리지와 특이성을 균형 있게 유지하는 표지 전략을 선택할 수 있는 프레임워크를 제공합니다. 이 접근법은 텔로미어 관련 단백질 네트워크의 포괄적이고 위치 특이적인 매핑을 위한 기초를 마련하며, 이는 암과 노화에서 염색체 말단 유지의 새로운 조절자를 밝힐 수 있습니다.|Telomeres are specialized nucleoprotein structures capping chromosome ends, maintained by the shelterin complex; one component, POT1, binds the single-stranded 3′ overhang and suppresses ATR-mediated DNA damage signaling. In ~10–15% of human cancers, telomere length is maintained by a recombination-based Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) pathway, which is characterized by persistent DNA damage at telomeres and ALT-associated PML bodies. Mapping the telomere interactome is thus crucial to understanding telomere maintenance mechanisms in normal and disease states. Proximity-dependent biotinylation can capture these networks in situ by tagging both stable and transient interactors. We therefore fused two engineered biotin ligases, TurboID and UltraID, to POT1 in ALT-positive U2OS cells to benchmark their performance for telomere proteomics. Here we show that both POT1–TurboID and POT1–UltraID localize to telomeres and mediate locus-specific biotinylation of neighboring proteins, but with distinct labeling profiles. TurboID–POT1 yields a strong, broad biotinylation pattern that recovers the full complement of shelterin subunits and multiple DNA repair and ALT-associated factors. UltraID–POT1 produces a more restrained labeling profile with reduced background, reflecting higher specificity for immediate telomeric interactors. These findings demonstrate that targeted proximity labeling can effectively probe the ALT telomeric proteome. By comparing TurboID and UltraID tagging, we provide a framework for choosing labeling strategies that balance proteome coverage and specificity. This approach lays the groundwork for comprehensive, locus-specific mapping of telomere-associated protein networks, which may reveal novel regulators of chromosome-end maintenance in cancer and aging.