Cited 0 time in webofscience Cited 0 time in scopus

Molecular mechanism of voltage-gated Ca2+ channel regulation by β-subunit

Title
Molecular mechanism of voltage-gated Ca2+ channel regulation by β-subunit
Authors
Jun-Hee Yeon
DGIST Authors
Suh, Byung-Chang; Yeon, Jun-Hee; Heo, Won Do
Advisor(s)
서병창
Co-Advisor(s)
Won Do Heo
Issue Date
2019
Available Date
2020-02-28
Degree Date
2019-02
Type
Thesis
Abstract
High voltage-activated (HVA) Ca2+ channels are voltage gated calcium channels that are distributed throughout the entire body and precisely regulate intracellular calcium influx to plays an important role in controlling diverse physiological processes, including neurotransmitter releases, hormone secretion, gene expression, muscle contractions. These high voltage-activated (HVA) Ca2+ channels are composed of pore-forming α1 and auxiliary α2δ and β subunits. Although it is well known that the β subunits of high voltage-gated Ca2+ (CaV) channels promote cell surface expression of pore-forming α1 subunits and regulate channel gating through binding to the α-interaction domain (AID) in the first intracellular loop, the stability of CaV α1-β subunit interaction remains controversial. Here, I addressed the stability of CaV α1B-β interactions by rapamycin-translocatable CaV β subunits that allow drug-induced sequestration and uncoupling of the β subunit from CaV2.2 channel complexes in intact living cells. Without CaV α1B/α2δ1, all modified β subunits, except membrane-tethered β2a and β2e, are in the cytosol and rapidly translocate upon rapamycin addition to anchors on target organelles: plasma membrane, mitochondria, or endoplasmic reticulum. In cells co-expressing CaV α1B/α2δ1 subunits, the translocatable β subunits co-localize at the plasma membrane with α1B and stay there after rapamycin application, indicating that interactions between α1B and bound β subunits are very stable. However, the interaction becomes dynamic when other competing β isoforMaster are co-expressed. Addition of rapamycin, then, switched channel gating and regulation by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphatate [PI(4,5)P2] lipid. Thus, expression of free β isoforMaster around the channel reveals a dynamic aspect to the α1B-β interaction. On the other hand, translocatable β subunits with AID-binding site mutations are easily dissociated from CaV α1B on the addition of rapamycin, decreasing current amplitude and PI(4,5)P2 sensitivity, and current recovery from Gβγ. Furthermore, the mutations slow CaV2.2 current inactivation and shift the voltage dependence of activation to more positive potentials. Mutated translocatable β subunits work similarly in CaV2.3 channels. In sum, the strong interaction of CaV α1B-β subunits can be overcome by other free β isoforMaster, permitting dynamic changes in channel properties in intact cells|전압 개폐 칼슘채널은 생체 내 다양한 조직에 분포하며, 세포내 칼슘이온 유입을 정밀 조절하여 신경전달물질과 호르몬 분비, 유전자 발현, 신경흥분성 조절, 근육의 수축 이완 등을 포함한 다양한 생리현상 조절에 중요한 역할을 한다. 이러한 칼슘채널은 α1 소단위체와 보조 소단위체인 β와 α2δ 소단위체로 구성되어 있으며, 그중 β 소단위체는 칼슘채널 α1 소단위체와 직접적인 결합을 통해 α1 소단위체를 세포 원형질막으로 수송하고 칼슘채널의 개폐를 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나 살아있는 세포에서 실시간으로 α1-β 소단위체의 결합 안정성에 대해서 연구를 진행하기엔 기술적 어려움이 있어 칼슘채널 연구진 사이에서 여전히 논란으로 남아있었다. 이러한 연구 필요성에 따라, 우리는 라파마이신 (Rapamycin) 유도 FKBP-FRB 이합체화 기법을 변형하여 살아 있는 세포에서 β 소단위체를 세포소기관인 미토콘드리아, 소포체 및 원형질막 등으로 실시간으로 이동시키며 눈으로 볼 수 있는 새로운 연구 기법을 개발하였다. 이를 패치클램프 기법과 동시에 적용하여 칼슘채널 α1-β 소단위체의 결합 안정성 및 β 소단위체의 분리가 칼슘채널에 주는 영향을 살아있는 세포에서 실시간으로 연구 하였다. 먼저, 세포질에 위치하는 β 소단위체는 칼슘채널 α1 소단위체와 함께 발현하게 되면 α1-β 소단위체 결합에 의해 세포 원형질막에 위치하며, 라파마이신을 처리하여도 미토콘드리아로 이동을 하지 않는다는 점을 발견하여 α1-β 소단위체의 결합이 매우 안정적이라는 사실을 밝혔다. 그러나 생체 내 일반 세포들처럼 2개 또는 그 이상의 동형 단백질 β 소단위체가 한 세포 내에 존재 할 때, β 소단위체의 결합이 상호 경쟁적으로 작용하여 α1-β의 결합이 다른 β 소단위체로 대체 된다는 점을 밝혔다. 더 나아가, β 소단위체의 α1 결합력을 돌연변이 유발하여 인위적으로 낮추면, 라파마이신에 의해 α1 소단위체로부터 쉽게 떨어지고 그 결과, muscarinic receptor Gβγ에 의한 억제정도가 β 소단위체의 유무에 따라서 다르게 조절되며 세포막 인지질 PI(4,5)P2에 의한 칼슘채널 억제 정도와 칼슘채널을 통해 세포내로 들어오는 칼슘 유입의 양이 줄어들었고, 채널 불활성화 속도가 느려졌으며, 전압의존성 채널 활성이 양의 방향으로 이동하였다. 이러한 결과는 다른 유형 칼슘채널 CaV2.3에서도 재현됨을 확인하였다. 연구결과를 종합해보면, 칼슘채널 α1-β 소단위체 결합은 매우 안정적이나 세포내 다른 유형의 β 소단위체에 의해 경쟁적 분리가 일어난다. 이는 칼슘채널 α1-β 소단위체의 결합이 역동적으로 일어나 세포 내 칼슘 이온 유입을 보다 정밀하게 조절하여 다양한 생리학적 현상을 조절할 가능성이 크다는 점을 보여준다. 또한, α1 소단위체와 결합하는 β 소단위체의 종류에 따라 칼슘 이온 유입 정도가 달라지고, β 소단위체의 결합과 분리가 칼슘채널의 활성을 상반되게 조절함으로 고혈압, 신경병증성 통증, 알츠하이머, 파킨슨 등의 치료법의 새로운 방향을 제시 할 수 있음을 시사한다.
Table Of Contents
I. INTRODUCTION 1 II. MATERIALS AND METHODS 8 III. RESULTS 13 Generation and characterization of translocatable CaV β subunits 13 Unlike palmitoylated β2a-FG, the electrostatically tethered β2e-FG isoform could translocate to mitochondria 16 The phenotype of interaction between CaV α1B and β subunits in cells 18 Interaction between CaV α1B and β subunits was stable in cells 21 A dynamic exchange of β subunits is revealed when two different β isoforMaster were expressed 30 Acute dissociation of β subunits from CaV2.2 channel complexes changes the gating properties 36 β subunits are required for CaV2.2 current recovery from Gβγ-mediated suppression 43 Dissociation of β subunits from α1B decreases the PI(4,5)P2 sensitivity of CaV2.2 channels 45 IV. DISCUSSION 47 Subcellular distribution of β subunits 47 Real-time effects of β subunit dissociation on CaV2.2 channel gating 48 Significance of β subunits for CaV2.2 channel regulation by PI(4,5)P2 49 Interaction properties of α1B-β subunits in intact cells and a closing hypothesis 50 Beneficial application and extent of translocatable CaV β subunit system 51 V. REFERENCE 54 VI. 국문요약 60
URI
http://dgist.dcollection.net/common/orgView/200000171526
http://hdl.handle.net/20.500.11750/10676
DOI
10.22677/thesis.200000171526
Degree
DOCTOR
Department
Brain and Cognitive Sciences
University
DGIST
Related Researcher
  • Author Suh, Byung-Chang Laboratory of Brain Signal and Synapse Research
  • Research Interests Molecular mechanisms of epilepsy and sensory pain transmission; Signaling mechanism of ion channel regulation and membrane excitability; 분자전기생리; 간질 및 통증의 분자적 기전 연구
Files:
There are no files associated with this item.
Collection:
Department of Brain and Cognitive SciencesThesesPh.D.


qrcode mendeley

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

BROWSE