The CCAAT-box transcription factor NF-Y complex mediates neuronal specification in C. elegans

Abstract

Neuronal differentiation is coordinated through a cascade of gene expression via inter-actions between trans-acting transcription factors and cis-regulatory elements of their target genes. However, the mechanisms by which transcriptional regulation determines neuronal cell fate are not fully understood. In C. elegans, the IL1 sensory/inter/motor neurons consist of six neurons that are peptidergic as well as glutamatergic. To identify molecular mechanisms by which IL1s are terminally differentiated, I performed mutagenesis screens and isolated nfya-1 mutants, in which flp-3 neuropeptide gene expression is decreased in IL1. nfya-1 encodes nu-clear transcription factor Y alpha subunit, which is highly conserved from yeast to humans. I found that NFYA-1 is expressed in and localized to the nuclei of IL1, and NFYA-1 expres-sion in the IL1 neurons of nfya-1 mutants restores flp-3 expression. Other IL1-expressed genes, including eat-4 vesicular glutamate transporter gene and unc-8 DEG/ENaC cation channel gene and differentially affected in nfya-1 mutants, suggesting that NFYA-1 regulates the expression of distinct terminal differentiation marker genes in IL1. In addition, I found that mutations in other subunits of NF-Y, NFYB-1, and NFYC-1, and a C. elegans paralog, NFYA-2, affect flp-3 expression in IL1. Then I performed promoter analysis of IL1-expressed genes and identified a motif necessary and sufficient for flp-3 expression that is similar to the mammalian CCAAT-box and directly bound by the NF-Y complex. Taken together, my data indicate that NFYA-1 regulates neuronal subtypes specification via directly regulating a set of terminal-differentiation marker genes.

신경은 발달 과정 중 특이적 성질을 지닌 특정 신경 세포로 정확히 분화되어야 하는데, 이 과정이 제대로 이루어 지지 않으면 여러 신경과 연관된 질병을 일으키게 된다. 이와 같이 신경은 신경 세포 내 특정한 유전자들이 발현하여야 그 신경 특이적인 분화가 진행되고 유지가 되는데, 이 과정은 trans-작용 (trans-acting)을 하는 전사인자 (transcription factor)와 cis-작용 (cis-regulatory)을 하는 DNA 부분 (motif)이 상호작용하여 표적 유전자 (target genes 혹은 terminal differentiation genes)들을 발현시킴으로써 이루어진다. 그러나 신경 세포의 세포 운명 (cell-fate)을 결정하는 전사조절 과정에 대해서는 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 예쁜 꼬마 선충 (Caenorhabditis elegans)은 302개의 신경으로 이루어진 비교적 간단한 모델 동물로써, 신경의 위치, 이름, 특징 및 신경회로에 관한 정보가 상당히 밝혀지고 명명되어 있어 신경 연구에 적합한 생물이다. 본 연구자는 이 예쁜 꼬마 선충의 여러 신경들 중 IL1 이라는 감각/개재/운동 신경을 이용하여 연구를 수행하였다. 이 IL1 신경은 6개의 개별 신경으로 이루어져 있고 펩티드성 (peptidergic) 및 글루탐산성 (glutamatergic) 신경전달물질을 매개로 신호를 전달한다고 알려져 있다. 본 연구자는 신경 세포의 특이적 분화 및 선별화 과정을 연구하기 위해 해당 신경의 표지 유전자인 flp-3 신경펩타이드 (neuropeptide) 유전자를 이용하여 무작위적인 돌연변이 생성 실험을 진행하였다. 그 결과 nfya-1 유전자가 결핍된 돌연변이를 찾았고, 해당 돌연변이에서 flp-3 표지 유전자의 발현이 정상적인 선충과는 달리 그 발현이 일부 약해짐을 확인하였다. 이 nfya-1 유전자는 Nuclear transcription factor Y (NF-Y) 라는 전사 복합체를 구성하는 a 소단위체를 암호화하고 있으며 해당 유전자는 예쁜 꼬마 선충 뿐만 아니라 초파리, 식물, 마우스 및 인간 유전자에도 보존되어 있는 중요 전사인자다. NF-Y 복합체는 여러 생물에서 생명현상을 유지하기 위해 필요한 전사인자이지만, 신경의 분화에 관한 연구는 많지 않았음을 확인하였다. 본 연구자는nfya-1 유전자가 실제로 IL1 신경의 핵에서 발현함을 확인하였고 돌연변이에 정상적인 nfya-1 유전자를 인위적으로 발현시켰을 때 돌연변이에서의 flp-3 유전자 발현형태가 정상으로 돌아오는 것을 확인했다. IL1 신경은 flp-3 말고도 eat-4 (vesicular glutamate transporter gene)와 unc-8 (DEG/ENaC channel gene) 이라는 유전자도 발현하는데, nfya-1 은 이러한 유전자들의 발현을 서로 다르게 조절함을 확인하였다. 이는 nfya-1 유전자가 IL1의 신경말단유전자 (terminal differentiation gene)를 서로 다르게 조절함을 의미한다. 이에 더해 NF-Y 전사복합체가 a, b, c의 세가지 소단위로 구성되어야 활성화된다는 점에 착안하여 nfyb-1, nfyc-1 유전자와 예쁜 꼬마 선충의 동종 상동 유전자 (paralog)인 nfya-2 유전자의 돌연변이들을 이용하여 flp-3, eat-4, unc-8 표지 유전자들의 발현을 확인하였고, NF-Y 전사복합체가 어떻게 IL1 신경의 특이적 분화를 조절하는지를 확인하였다. 또한 IL1 신경의 표지 유저자인 flp-3, eat-4, unc-8의 프로모터 (promoter)를 분석하여 flp-3 표지 유전자의 프로모터 상에 NF-Y 복합체가 결합한다고 알려진 CCAAT-box를 확인하였다. 이는 NFYA-1이 직접적으로 결합하여 flp-3 유전자 발현을 조절함을 시사한다. 이러한 결과들을 통해 본 연구자는 NF-Y 복합체가 신경말단유전자를 서로 다르게 조절하여 신경 하위 유형 (subtype)의 선별화를 유도할 수 있음을 밝혀냈다.