Baf-mediated transcriptional regulation of teashirt is essential for the development of neural progenitor cell lineages

Abstract

Accumulating evidence hints heterochromatin anchoring to the inner nuclear membrane as an upstream regulatory process of gene expression. Given that the formation of neural progenitor cell lineages and the subsequent maintenance of postmitotic neuronal cell identity critically rely on transcriptional regulation, it seems possible that the development of neuronal cells is influenced by cell type-specific and/or context-dependent programmed regulation of heterochromatin anchoring. Here, I explored this possibility by genetically disrupting the evolutionarily conserved barrier-to-autointegration factor (Baf) in the Drosophila nervous system. Through single-cell RNA sequencing, I demonstrated that Baf knockdown induces prominent transcriptomic changes, particularly in type I neuroblasts. Among the differentially expressed genes, through a series of genetic analyses, I identified teashirt (tsh), a transcription factor that interacts with beta-catenin, to be closely associated with Baf knockdown-induced phenotypes that were suppressed by the overexpression of tsh or beta-catenin. I also found that Baf and tsh colocalized in a region adjacent to heterochromatin in type I NBs. Notably, the subnuclear localization pattern remained unchanged when one of these two proteins was knocked down, indicating that both proteins contribute to the anchoring of heterochromatin to the inner nuclear membrane. Overall, this study reveals that the Baf-mediated transcriptional regulation of teashirt is a novel molecular mechanism that regulates the development of neural progenitor cell lineages.|신경계는 다양한 종류의 뉴런과 신경교세포를 포함한 다양한 세포 구성요소로 이뤄져 있다. 신경계를 구성하는 세포들은 신경계 전구세포로부터 특정 세포 유형으로 발달 과정을 겪고, 이는 엄격히 통제된 생성을 필요로 한다. 이런 신경 발달은 세포의 정체성을 결정하는 전사 인자들의 시간 및 공간적인 발현 조절로 이뤄지며, 이는 세포 계보의 형성 뿐 아니라 분열 후 해당 신경 세포의 정체성 유지에 중요하다. 하지만, 신경계 발달 기간동안 세포 유형 특이적, 발달 단계 특이적으로 어떤 상위 활성화 인자나 신호 또는 조절 과정이 이러한 전사 인자들의 활성이나 양에 영향을 주어 신경계 발달을 일으키는지 대부분 알려지지 않았다. 이와 관련하여, 유전자 발현 조절에 있어서 더 높은 차원의 후생유전학적 조절인 염색체 수준에서의 역할: 1) 크로마틴의 응축 및 이완 상태의 동적 변화, 2) CTCF/코헤신 루핑을 통한 크로마틴 내 작은 구획 도메인의 동적 형성 및 해체, 그리고 3) 핵 내 크로마틴의 위치 조절 등이 최근 연구에서 주목되어 왔다. 신경 발달 과정 중 광범위하게 연구된 다른 앞선 두 특징에 비하여, 핵 내 크로마틴의 위치 설정에 대한 상세한 조절 매커니즘과 관련된 인자들은 상대적으로 연구가 부족한 상황이다. 내부 핵막으로의 이질염색질 고정은 크로마틴의 핵 내 위치 조절에 중요하다. 이를 매개한다고 알려진 크로마틴 결합 단백질에는 진화적으로 보존된 Baf를 포함하여 PRR14, cec-4 등이 알려진 바 있다. 해당 단백질들은 내부 핵막에 존재하는 LEM (LAP2, Emerin, MAN1) 도메인을 가진 단백질들과 같은 핵 라민 관련 단백질들과 상호작용하여, 크로마틴과 핵 라민 사이의 물리적 상호작용을 매개한다. 이런 내부 핵막에 대한 이질염색질 고정은 주로 세포분열 중 염색체의 분리와 분열 후 핵막의 재조립에서의 역할이 잘 알려져 있으나, 크로마틴 결합 단백질들은 유전자 발현 조절에서도 주요한 역할을 수행한다. Baf의 경우, 프로모터 영역과의 직접적인 상호작용, 후성유전학적 조절자들의 모집, 그리고 히스톤 변형을 통한 표적 유전자들의 전사 조절과도 관련이 있다. 더욱이, 발달 과정에서 특정 세포 유형으로의 세포분화에 있어서 크로마틴 결합 단백질이 관련 유전자의 발현을 매개한다고 알려져있다. 예시로, Baf의 예쁜꼬마선충 상동유전자인 baf-1은 근육 세포의 분화의 결함 및 표피 세포의 조기융합과 같은 결함과 함께 성체의 체구 크기 감소를 일으킨다는 보고가 있으며, PRR14는 HP1alpha와의 상호작용을 통해 특정 표적 유전자, MyoD, 의 전사조절을 매개로 근아세포의 분화에도 영향을 준다. 이러한 관점에서 본 논문에서는 초파리를 모델로 사용하여 내부 핵막으로의 이질염색질 고정에 의존적으로 조절되는 전사가 세포 특이적으로 신경발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하였다. 크로마틴 결합 단백질 중, PRR14나 cec-4의 경우, 알려진 초파리 상동유전자가 없기 때문에 진화적으로 보존된 Baf에 초점을 맞추었다. 완전한 Baf-null 돌연변이의 경우, 유충에서 번데기 전환기간 동안 치사를 초래하기 때문에 Baf의 기능과 양을 감소시키는 Baf 녹다운 초파리를 이용하여 실험을 진행하였다. 우선, 신경 발달 과정 중 세포 특이적으로 미치는 영향을 조사하기 위해서 유충 단계의 초파리 뇌를 사용하여 단일 세포 전사체 분석을 진행하였고, 어느 세포에서 가장 크게 영향을 받는지 확인하였다. 초파리의 종류 1 신경 모세포에서 Baf 녹다운에 의하여 변화된 전사체의 종류 및 발현도가 다른 종류의 신경 모세포에 비하여 가장 크게 변화가 발생하였다는 사실을 확인하였다. 이를 통해, 본 연구자는 Baf의 종류 1 신경 모세포 내 역할을 살펴보기 위해서 종류 1 신경 모세포 특이적으로 녹다운을 진행한 결과, 이질염색질의 내부 핵막으로의 고정에 결함이 발생하여 핵 중심부에 대부분 위치하고 있다는 것을 확인하였다. 또한, 종류 1 신경 모세포의 세포 계보 형성을 살펴보니, 비대칭 분열 및 neural progeny 형성에 결함이 발생한다는 것을 알 수 있었고, 이는 종류 1 신경 모세포 특이적으로 발생하였다. 다음으로, 각 종류의 신경 모세포들의 세포 계보 형성 과정을 단일 세포 전사체 분석 데이터를 사용하여 예측해본 결과, 종류 1 신경 모세포에서 특이적으로 세포 계보 형성에 문제가 발생하였다는 것을 확인하였다. 이를 실험적으로 검증하기 위하여 neural progeny들의 fate를 결정하는데 문제가 발생하는지 살펴보았다. Neural progeny의 fate determinant인 pros, elav를 면역염색법으로 살펴본 결과, Baf를 녹다운 시킨 종류 1 신경 모세포로부터 형성된 neural progeny 내에서 거의 관찰되지 않아 정상적으로 분화되지 못하고 있다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 이런 비정상적인 분화가 성체 단계에서 어떤 영향을 미치는지 살펴보니, 발달 단계에서 Baf 녹다운을 일으킨 경우, 성체 단계에서 행동 이상 (Grooming, Immobility)과 함께 날개의 각도 이상이 관찰되었다. 여기서 나아가 본 연구자는 Baf 녹다운으로 인한 종류 1 신경 모세포의 전사체들의 변화가 어떻게 신경 발달 및 행동 이상에 영향을 미치게 되는지 실질적인 매개체를 발굴하고 관련 매커니즘을 연구하였다. 이를 찾기 위하여, Baf 녹다운 환경에서 전사체의 발현도가 달라진 인자 275개 중 초파리 라인으로 존재하는 117개의 인자를 종류 1 신경 모세포 특이적으로 각자의 발현도에 맞추어 녹다운 시키거나 과발현시킨 다음, Baf 녹다운에 의한 성체 단계에서의 표현형: 1) 날개의 각도 변화와 2) 행동 이상을 나타내는 인자를 찾는 스크리닝을 진행하였다. 우선 19개의 발현이 감소된 인자, 2개의 과발현된 인자에서 날개의 각도 이상이 관찰되었으며, 그 중 11개의 발현이 감소한 인자에서 행동 이상이 관찰되었다. 매개체로서의 역할을 검증하기 위하여 본 연구자는 후보 인자들을 반대로 과발현시켰을 경우 Baf 녹다운에 의한 행동 이상을 완화시킬 수 있는지 살펴보았다. 11개의 인자 중 4 종류 (tsh, msk, Caf1-55, mts) 만이 초파리 라인으로 사용 가능하였고, 이 중 tsh와 msk 만이 행동 이상을 완화시켜 후보 매개체로 선정하였다. 하지만, msk의 경우, Baf 녹다운에 의해 발생한 행동 이상 (Grooming, immobility) 과는 달리 tremor와 같은 행동이 나타났기에, tsh를 관련 매커니즘을 밝히는데 주요한 매개체로 상정하여 연구를 진행하였다. 다음으로, 어떤 신호전달경로가 후보 매개체인 tsh와 msk와의 상호작용으로 이러한 신경 모세포의 발달에 영향을 줄 수 있는지 알아보기 위하여 단백질-단백질 간 네트워크를 조사해본 결과, Wnt signaling 과정에 속한 beta-catenin 의 초파리 상동유전자인 Armadillo (Arm) 이 관련성이 있다는 것을 찾았다. 이에, Arm의 자체적인 효과를 살펴보기 위해 종류 1 신경 모세포 특이적으로 발현을 감소시켜보았더니, Baf 녹다운에 의한 효과와 같이 행동 이상이 관찰되었다. 또한 Baf 녹다운에 의한 행동이상을 Arm의 과발현으로 완화시킬 수 있는지도 확인해보니, 행동 이상을 큰 폭으로 완화시키는 것을 확인하였다. 이렇게 찾아낸 tsh와 Arm이 Baf 녹다운에 의한 성체 단계에서의 결함을 일으키는데 영향을 줄 수 있음을 확인하였기에, 실제로 종류 1 신경 모세포의 세포 계보를 형성하는데 자체적으로 영향을 주는지 확인해보았다. Baf와는 달리, tsh와 Arm은 종류 1 신경 모세포의 neural progeny cell형성 및 개수에는 영향을 주지 않았으나, neural progeny들의 fate determinant인 pros의 양이 큰 폭으로 감소하여 세포 계보를 형성하는데 영향을 주는 것을 확인하였다. 그리고 이질염색질의 내부 핵막 고정에도 영향을 주는지 살펴보니, Baf 녹다운 환경과 같이 핵 중심부에서 이질염색질이 관찰되었다. 추가로, 관련 매커니즘을 자세히 알아보기 위하여 주요 매개체들의 세포 내 위치를 면역염색법으로 확인해본 결과, Baf 와 tsh는 핵 내부에서 동일한 위치에 존재하는 것을 보였고, 염색질 주변을 둘러싼 형태로 관찰되었다. Baf와 tsh가 동일한 위치패턴을 나타내고 있다는 사실을 기반으로 이질염색질의 내부 핵막으로의 고정 기능은 어떻게 수행하는지 알아보기 위하여 tsh를 녹다운 시켜본 결과, Baf의 위치는 동일하게 변하지 않았으나, 이질염색질의 위치가 핵 중심부로 이동한 것을 관찰하였다. 이를 통해 tsh는 Baf와 함께 이질염색질의 내부 핵막으로의 고정을 수행한다는 것을 알 수 있었다. 마지막으로, Baf 녹다운 환경에서 tsh 와 Arm의 과발현이 종류 1 신경 모세포의 세포 계보 형성 결함을 완화시킬 수 있는지 조사해보았다. Baf 녹다운에 의해 제대로 형성되지 못한 종류 1 신경 모세포와 neural progeny들의 개수를 정상 수준으로 회복시키는 것을 확인하였다. 또한, 해당 인자들의 과발현으로 neural progeny 내부에서 pros의 양도 일부 증가시키는 것을 확인했으며, 종류 1 신경 모세포 내 이질염색질의 내부 핵막으로의 고정도 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 연구자는 tsh라는 새로운 인자를 발굴할 수 있었고, 해당 인자는 종류 1 신경 모세포의 세포 계보 형성에 Baf의 하위 매개 인자로서 주요한 역할을 수행하며, 이질염색질 고정에도 Baf와 함께 역할을 수행한다는 것을 증명하였다.