Sequential stacked deep optical microscopy based on dual-energy induced gas bubbles

Abstract

Optical microscopy is widely employed in biomedical research for its high spatial resolution and minimally invasive capabilities. However, its application to deep-tissue imaging is fundamentally restricted by photon scattering, which severely limits penetration depth. To address this, ultrasound-assisted techniques such as Ultrasound-induced Optical Clearing Microscopy (US-OCM) and Optrasound-induced Deep Optical Microscopy (OPS-DOM) have been developed. While these methods successfully extend imaging depth by generating optical clearing bubbles, they suffer from structural limitations; specifically, adjusting the bubble generation region requires replacing the ultrasound transducer, which hinders flexible depth control and introduces alignment errors. To overcome these limitations, this study proposes Sequential Stacked Deep Optical Microscopy (SS-DOM), a novel imaging approach that utilizes a single 3 MHz ultrasound transducer to sequentially generate bubbles at varying depths. By combining optical and ultrasonic energies, the system forms Optrasound-induced Optical Clearing Bubbles (OPS-OCB) in the first standing wave region and Ultrasound-induced Optical Clearing Bubbles (US-OCB) in the second region. This dual-mode capability allows for the sequential acquisition of high-resolution images from the superficial to the deep region without any physical modification of the experimental setup. The proposed method predicted the size of the bubble cloud to be generated through Finite Element Method (FEM) simulations and validated this through tissue- mimicking phantom experiments. As predicted, results confirmed the formation of OPS-OCB (~150 µm) and US-OCB (~309 µm). Quantitative evaluation using fluorescent beads demonstrated that SS-DOM maintains a lateral resolution of approximately 1.55 µm even at a depth of 350 µm, which is comparable to that of the superficial region. Furthermore, the signal intensity in deep tissue was recovered to over 90% of the superficial level. These findings indicate that SS-DOM effectively mitigates the depth–resolution trade-off, offering a robust and efficient solution for high-resolution volumetric imaging of deep biological tissues.

Keywords: Optical clearing bubble, Confocal microscopy, HIFU|광학 현미경은 높은 공간 해상도와 최소 침습적인 특성 덕분에 생의학 연구 분야에서 널리 사용되고 있다. 그러나 생체 조직 내에서 발생하는 광 산란 현상은 빛의 침투 깊이를 크게 제한하여 심부 조직 영상화에의 적용을 어렵게 만든다. 이러한 한계를 극복하기 위해 초음파 유도 광학 투명화 현미경(US-OCM)과 광-초음파 유도 심층 광학 현미경(OPS-DOM) 등의 기술이 개발되었다. 이들 기술은 광학 투명화 버블을 생성하여 영상 깊이를 확장하는 데 성공하였으나, 버블 생성 영역을 변경하기 위해서는 초음파 변환기를 물리적으로 교체해야 한다는 한계를 가진다. 이는 유연한 깊이 제어를 저해하고 실험 중 정렬 오차를 유발하는 원인이 된다. 이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구에서는 단일 3 MHz 초음파 변환기를 사용하여 서로 다른 깊이에서 순차적으로 버블을 생성하는 순차적 적층형 심층 광학 현미경(Sequential Stacked Deep Optical Microscopy, SS-DOM)을 제안한다. 본 시스템은 광 에너지와 초음파 에너지를 결합하여 첫번째 정재파 영역에는 광-초음파 유도 광학 투명화 버블(OPS-OCB)을, 두번째 정재파 영역에는 초음파 유도 광학 투명화 버블(US-OCB)을 형성한다. 이러한 이중 모드 기능을 통해 시스템의 물리적 변경 없이 표재성 영역부터 심층 영역까지 고해상도 영상을 순차적으로 획득할 수 있다. 제안된 방법은 유한요소해석(FEM) 시뮬레이션을 통해 생성될 버블 클라우드의 크기를 예측하고, 생체 모사 팬텀 실험을 통해 이를 검증하였다. 실험 결과, 예측된 바와 같이 약 150 µm 크기의 OPS-OCB와 약 309 µm 크기의 US-OCB가 형성됨을 확인하였다. 형광 비즈를 이용한 정량적 평가에서 SS-DOM은 350 µm 깊이의 심층 영역에서도 표재성 영역과 대등한 수준인 약 1.55 µm의 측면 해상도를 유지하였다. 또한, 심부 조직 내 신호 강도가 표재성 수준의 90% 이상으로 회복됨을 확인하였다. 이러한 결과는 SS-DOM이 깊이와 해상도 간의 상충 관계(trade-off)를 효과적으로 완화하며, 심부 생체 조직의 고해상도 3차원 영상화를 위한 견고하고 효율적인 솔루션임을 입증한다.

핵심어: 광학 투명화 공기방울, 공초점 현미경, 고강도 집속 초음파