Molecular mechanism of TMEM16E scramblase activation inducing ligand-independent growth factor receptor signaling and macropinocytosis for membrane repair

Abstract

TMEM16E 단백질은 인간의 근육세포에 많이 발현하며 근위축증 (MMD3, LGMD2L)및 골형성이상 (GDD)과 관련이 있다. TMEM16E는 칼슘 의존적으로 작동하는 이온 채널 및 인지질 스크램블레이즈 단백질로, 세포막의 인지질 비대칭 조절에 중요하게 관여한다. 포스파티틸세린 (PS)의 외부 노출은 세포사멸뿐 아니라 세포막 손상 시 복구 신호로도 작용할 수 있다. TMEM16F는 이러한 복구 과정에 중요한 역할을 하며, TMEM16E 역시 유사한 기능이 있을 것으로 추정되고 있으나 TMEM16E를 통한 PS 노출이 구체적으로 어떠한 메커니즘을 통해 세포막 복구를 유도하는지는 아직 규명되지 않았다. 따라서 본 연구자는 TMEM16E 스크렘블레이즈의 활성이 세포막 복구를 야기하는 분자적 메커니즘을 규명하였다. 본 연구에서는 칼슘 의존성 인지질 스크램블레이즈인 TMEM16E가 세포 내 칼슘 증가에 따라 활성화되면, 세포막 외부로 노출된 PS가 Annexin V와 결합한 뒤 세포질로 내재화 되는 특이적인 현상을 관찰하였다. 위와 같은 현상은 거대음세포작용 억제제인 아밀로라이드에 의해 완전히 억제되었으며 이로 인해 TMEM16E 스크램블레이즈가 거대음세포작용을 유도함을 확인하였다. 또한, 공동면역침전을 통해 TMEM16E와 성장인자 수용체 (EGFR, PDGFR)가 직접적으로 결합하며, TMEM16E 스크램블레이즈가 리간드 비의존적 성장인자 수용체의 활성화를 유도함을 확인하였다. 이 과정은 PI3K 경로를 활성화시키며, 이러한 메커니즘을 통해 스크램블링 활성 동안 세포막 완전성이 거대음세포작용에 의해 안정적으로 조절됨을 관찰하였다. 따라서 TMEM16E 스크램블레이즈에 의해 야기되는 거대음세포작용이 세포막 복구에 기여할 수 있음을 규명하였다. TMEM16E의 돌연변이는 근육 및 골격계 이상과 관련이 있으며, 이는 체내 pH 환경과 에너지 대사에 영향을 줄 수 있다. 또한, 격렬한 운동은 근육의 일시적인 산성화를 유도할 수 있어, TMEM16E의 pH 의존적 조절 메커니즘을 규명하는 것은 중요하다. 따라서 본 연구자는 TMEM16E 스크램블레이즈 및 TMEM16E 매개 거대음세포작용이 세포 외 수소이온 농도 변화에 따라 조절되며, 이는 칼슘 클리어런스 경로에 관여하는 Ca2+/H+ exchanger를 통해 매개됨을 확인하였다. 산성 조건에서는 Ca2+/H+ exchanger활성이 증가함으로써 세포 내 칼슘이 빠르게 감소하여 TMEM16E의 활성이 억제되고, 따라서 거대음세포작용도 빠르게 중단되었다. 그러나 알칼리 조건에서는 Ca2+/H+ exchanger의 활성이 증가하여 고농도의 칼슘이 유지된다. 따라서 TMEM16E의 활성이 지속적으로 일어나게 됨으로써 거대음세포작용이 지속되었다. 특히, 산성 조건에서는 세포 내 칼슘이 빠르게 감소하고 거대음세포작용이 일시적으로 일어남으로써 스크램블레이즈 활성 동안 세포막 완전성이 완전히 유지되었다. 또한, TMEM16E 매개 거대음세포작용 동안 세포 분열 및 생존이 TMEM16E가 발현되지 않은 세포보다 증가하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, 본 연구는 TMEM16E 스크렘블레이즈 활성화가 리간드 비의존적 성장인자 수용체 신호 및 거대음세포작용을 야기함으로써 세포막 복구 및 세포 생존을 조절할 수 있는 분자기전을 제시한다. 또한 TMEM16E 매개 거대음세포작용이 세포 외 pH에 따라 조절될 수 있음을 보여줌으로써 병리생리학적 조건에서 TMEM16E 스크램블레이즈가 세포 생존을 위한 중요한 인자로 작용할 수 있음을 제시한다.|The calcium-dependent phospholipid scramblase TMEM16E mediates ion transport and lipid translocation across the plasma membrane. TMEM16E also contributes to protection of membrane structure by facilitating cellular repair signaling. My research reveals that TMEM16E activation promotes macropinocytosis, essential for maintaining plasma membrane integrity. This scramblase externalizes phosphatidylserine, typically linked to resting growth factor receptors. I demonstrate that TMEM16E can interact with and signal through growth factor receptors, including epidermal growth factor receptors, even without ligands. This interaction stimulates downstream phosphoinositide 3-kinase and facilitates macropinocytosis and internalization of annexin V bound to the membrane, a process sensitive to amiloride inhibition. Although TMEM16E is internalized during this process, it returns to the plasma membrane. TMEM16E-driven macropinocytosis is proposed to restore membrane integrity after perturbation, potentially explaining pathologies in conditions like muscular dystrophies, where TMEM16E functionality is compromised, highlighting its critical role in muscle cell survival. Various mutations of TMEM16E are related to muscular dystrophy and bone dysplasia, which can indirectly affect pH environments in the body by muscle damage, and energy metabolism. Therefore, understanding the pH-dependent molecular mechanism of TMEM16E is crucial, but it remains unclear. Here, I show the TMEM16E scramblase and TMEM16E-mediated macropinocytosis were regulated by extracellular protons via Ca2+ clearance pathways. In acidic conditions, TMEM16E scrambling activity and macropinocytosis rapidly stopped, and intracellular calcium quickly decreased to basal levels compared to physiological conditions. Conversely, under alkaline conditions, TMEM16E scrambling activity and macropinocytosis remained persistently active, and intracellular calcium levels were highly elevated. Interestingly, TMEM16E-mediated macropinocytosis modulated membrane integrity and cell viability under acidic conditions. I demonstrate that extracellular acidification enhances cell survival by promoting TMEM16E-mediated macropinocytosis. In summary, this study uncovers a molecular mechanism by which TMEM16E scramblase activation drives ligand-independent growth factor receptor signaling and macropinocytosis, thereby facilitating membrane repair and contributing to cell survival under stress conditions.