High-Frequency Sonogenetic Modulation of Neural Activity via Diverse Ultrasound-Responsive Ion Channels in Mice in vivo

Abstract

비침습적이고 정밀한 신경활동 조절은 뇌 기능 이해와 신경조절 기전 연구에 필수적이다. 최근 초음파는 심부 뇌 영역까지 도달할 수 있는 잠재적 자극 도구로 주목받고 있으나, 뉴런에서 초음파에 반응하는 분자적 기반（molecular substrate）은 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 다양한 기계감응성 이온채널（mechanosensitive ion channels）을 체계적으로 선별하여 초음파 자극에 반응하는 채널들을 확인하고, 이들의 생리학적 특성을 in vitro와 in vivo에서 분석하였다. 전기생리학적 스크리닝 결과, hsTRPA1, hsTRPV1, Piezo1, EcMscL은 초음파 자극에 의해 탈분극 반응을 유도하는 흥분성 sonochannel로, TREK-1과 CFTR은 과분극을 통해 신경 활성을 억제하는 억제성 채널로 작용함을 확인하였다. 이 중 CFTR은 유전자 크기 문제로 in vivo 실험에 사용할 수 없었으며, Piezo1은 구조적 유사성을 지닌 TMEM87A로 대체하여 생체 내에서의 반응성을 검증하였다. 고주파 초음파（4 MHz, 10 Hz PRF, 50% duty cycle） 자극을 적용한 결과, TMEM87A 발현 뉴런에서는 강하고 지속적인 c-Fos 발현 증가 및 칼슘 신호 상승이 관찰되었으며, 반대로 TREK-1 발현 뉴런에서는 신경활성이 억제되는 양상이 나타났다. 이는 초음파 자극이 채널의 이온 선택성에 따라 양방향적（bidirectional） 신경조절을 유도할 수 있음을 의미한다. 또한 fiber photometry를 이용한 실시간 칼슘 기록을 통해 채널별로 상이한 반응 양상을 정량적으로 비교함으로써, 초음파에 대한 채널 특이적 반응성을 확인하였다. 등쪽내측 선조체（dorsomedial striatum, DMS）에서의 sonogenetic 조절이 행동학적 결과로 이어지는지 검증하기 위해, DMS에 TMEM87A 또는 TREK-1을 발현시킨 마우스를 대상으로 4 MHz FUS 자극 하에 트레드밀 보행 실험을 수행하였다. DMS는 목표 지향적 행동의 순차적 실행에 관여하는 영역으로, TMEM87A 발현 마우스에서는 초음파 자극 중 최대 보행 속도와 누적 이동 거리가 유의하게 증가한 반면, TREK-1 발현 마우스에서는 유의하게 감소하였다. 야생형 대조군에서는 유의한 변화가 관찰되지 않아, 행동 조절이 sonochannel 의존적임을 확인하였다. 억제성 sonogenetic 조절의 치료적 가능성을 검증하기 위해, 측두엽 간질（temporal lobe epilepsy, TLE）의 주요 병변 부위인 해마 치상회（hippocampal dentate gyrus, DG）에 TREK-1을 발현시키고, 카인산（kainic acid, KA） 투여로 유발된 발작에 4 MHz FUS를 적용하였다. TREK-1 발현 마우스에서는 대조군에 비해 최대 Racine 점수가 유의하게 감소하고, 발작 없는 구간（seizure-free period）이 유의하게 연장되었다. 특히 발작 억제 효과는 FUS 자극 중보다 자극 종료 이후에 더 두드러지게 나타났으며, 이는 성상세포-GABA 네트워크 활성화 및 GABAergic 억제 회로의 지속적 작동에 의한 것으로 해석된다. FUS 중단 후 발작이 부분적으로 회복된 점은 이 억제 효과가 가역적임을 시사한다. 이러한 결과는 초음파가 단순한 물리적 자극이 아닌, 세포 유형 특이적 생물학적 조절 인자로 작용할 수 있음을 보여준다. 본 연구는 TMEM87A가 새로운 초음파 반응성 이온채널로 기능할 수 있음을 제시하고, TREK-1을 통한 억제성 sonogenetic 조절이 병리적 과흥분성 완화에 활동될 가능성을 제시하였다. 이를 통해 채널 유형에 따른 양방향적（channel-dependent） sonogenetic 신경조절의 생물학적 기반을 제시하고, 비침습적·가역적·세포 특이적 뇌 회로 조절 기술의 신경질환 치료 적용 가능성을 제시하였다.|Precise and non-invasive control of neural activity is essential for understanding brain function and developing neuromodulatory strategies. Ultrasound has recently emerged as a promising tool for deep-brain stimulation. However, the molecular basis of ultrasound responsiveness in neurons remains largely unclear. Here, I systematically screened multiple mechanosensitive ion channels to identify those capable of mediating sonogenetic modulation and validated their distinct response profiles both in vitro and in vivo. Electrophysiological recordings revealed that hsTRPA1, hsTRPV1, Piezo1, and EcMscL function as excitatory sonochannels, while TREK-1 and CFTR act as inhibitory channels under ultrasonic stimulation. Based on these findings, TMEM87A, a Piezo-like mechanosensitive protein, was selected as a candidate for in vivo sonogenetic activation due to its suitable size and structure for viral expression. In vivo ultrasound stimulation （4 MHz, 10 Hz PRF, 50% duty cycle） demonstrated that TMEM87A-expressing neurons exhibited substantial and sustained increases in c-Fos expression and calcium activity. In contrast, TREK-1-expressing neurons exhibited suppressed activity, indicating that ultrasound can evoke bidirectional modulation of neural activity, depending on the type of channel. Real-time fiber photometry recordings further confirmed distinct calcium dynamics across channels, highlighting channel-specific excitatory or inhibitory patterns during stimulation. To assess whether sonogenetic modulation of the dorsomedial striatum （DMS） could extend to behavioral outcomes, mice expressing TMEM87A or TREK-1 in the DMS were subjected to a treadmill locomotion test during 4 MHz FUS stimulation. TMEM87A-expressing mice exhibited a significant increase in both maximal running speed and total running distance during ultrasound stimulation, consistent with excitatory activation of striatal circuits that promote goal-directed locomotion. Conversely, TREK-1-expressing mice showed a significant reduction in locomotor performance, reflecting the inhibitory hyperpolarization mediated by K⁺ efflux. Wild-type control mice showed no significant change, confirming that behavioral modulation was sonochannel-dependent. These findings suggest that sonogenetic inhibition via TREK-1 can attenuate pathological hyperexcitability in vivo highlight the potential of high-frequency sonogenetics as a non-invasive strategy for modulating disease-relevant neural circuits. To further validate the functional relevance of inhibitory sonogenetic modulation, I examined whether focused ultrasound （FUS）-driven TREK-1 activation in the hippocampal dentate gyrus （DG） could suppress seizure activity in a kainic acid （KA）-induced temporal lobe epilepsy model. AAV-mediated expression of TREK-1 in the hippocampal DG, combined with 4 MHz FUS stimulation, significantly reduced maximal Racine scores and prolonged seizure-free intervals compared to control animals. These results demonstrate that sonogenetic inhibition via TREK-1 can attenuate pathological hyperexcitability in vivo, extending the utility of high-frequency sonogenetics beyond circuit-level neuromodulation toward potential therapeutic applications. Collectively, these results reveal that ultrasound can serve as a cell-type–specific biological modulator, rather than a purely physical stimulus, and provide evidence supporting TMEM87A as an ultrasound-responsive ion channel. This study establishes the biological foundation for bidirectional, channel-dependent sonogenetic neuromodulation, opening new possibilities for precise, non-invasive, and reversible control of brain circuits with direct implications for neurological disease therapy.