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Discovering therapeutic target genes for neovascular diseases using a pooled CRISPR screen targeting cell membrane proteins

Discovering therapeutic target genes for neovascular diseases using a pooled CRISPR screen targeting cell membrane proteins
Alternative Title
세포막 단백질을 이용한 신혈관생성 질병에 대한 치료 표적 유전자 발굴
Jungin Lee
DGIST Authors
Jungin LeeKim Jong KyoungYea Kyungmoo
Yea Kyungmoo
Issued Date
Awarded Date
"혈관 신생성", "크리스퍼 스크리닝", "TSPAN10", "혈관내피세포의 증식", "RNA-seq 분석", "Notch signaling", "세포 주기","Angiogenesis", "CRISPR/Cas9 knockout screening" ,"therapeutic antibody drug"
"혈관 신생성", "크리스퍼 스크리닝", "TSPAN10", "혈관내피세포의 증식", "RNA-seq 분석", "Notch signaling", "세포 주기","Angiogenesis", "CRISPR/Cas9 knockout screening" ,"therapeutic antibody drug"
혈관 신생성은 기존에 있던 혈관으로부터 새로운 혈관이 만들어지는 생리학적 현상을 의미한다. 혈관 신생성은 혈관 항상성을 유지하기 위해 혈관신생인자와 항혈관신생인자 사이의 균형에 의해 매우 엄격하게 조절이 된다. 이러한 혈관 신생성은 배아의 발달을 포함하여 성인의 생리학적 회복 과정 등에 필수적인 과정이지만, 비정상적인 혈관 생성은 암과 황반변성을 포함한 많은 질병에서 나타나는 특징이다. 비정상적인 혈관 생성은 혈관신생인자와 항혈관신생인자 사이의 불균형에 의해 일어난다. 이러한 비정상적인 혈관 생성 치료하기 위해서 항혈관생성 요법이 많이 연구되고 있다. 그 중 항VEGF 치료법이 신생혈관 질환을 치료하기 위한 대표적인 치료 방법으로 많이 이용된다. 그러나, 항VEGF치료법은 종종 치료에 대한 저항과 혈관 신생적 재발을 겪는다. 그렇기 때문에, VEGF를 대체할 강력하고 신뢰할 수 있는 치료 항체 약물을 발굴하고 혈관 신생을 조절하는 새로운 치료법을 개발하는 것이 필요하다. 본 연구에서는 치료 항체를 위한 혈관내피세포의 증식에 영향을 미치는 새로운 치료 항체 약물 표적 유전자들을 발굴하기 위해 인간 제대 정맥 내피세포에서 세포막 단백질을 표적으로 하여 크리스퍼 녹아웃 스크리닝을 진행하였다. 크리스퍼 스크리닝을 통해, 6개 치료 항체 약물 표적 후보 유전자인 ADAM15, CXorf66, DCBLD1, TMEM204, TSPAN10, VSTM5를 선정하였다. 6개의 후보유전자들 중에, 후보유전자들의 각각의 녹아웃 세포주에서 세포증식과 이동의 능력을 평가하여 TSPAN10이 가장 가능성 있는 표적 유전자로 선정되었다. RNA-seq 분석은 또한 TSPAN10 녹아웃 세포와 정상 세포를 비교하여 Notch signaling과 혈관 신생성에 관련된 유전자들의 발현이 감소하였고, 세포 주기 조절을 억제하는 유전자의 발현은 증가하는 것을 보여주었다. 본 논문을 통하여 TSPAN10은 치료 항체를 위한 항 혈관 신생 표적 유전자로서의 가능성을 보여준다.|Angiogenesis is a biological process that new blood vessels form from pre-existing vessels. It is tightly regulated by the balance between pro-angiogenic and anti-angiogenic factors to maintain vascular homeostasis. Even though angiogenesis is crucial for the embryonic development and physiological repair processes, abnormal angiogenesis is a hallmark of many diseases including cancer and age-related macular degeneration. The abnormal angiogenesis occurs by the imbalance between pro-angiogenic and anti-angiogenic factors. To treat abnormal angiogenesis, anti-angiogenic therapies have been developed. Among those, anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapy is a major therapeutic option to treat neovascular diseases. However, anti-VEGF therapy usually suffers from the angiogenic relapse and resistance to the treatment. Therefore, it is necessary to discover more robust and reliable targets for therapeutic antibody drugs instead of VEGF and develop new therapeutic strategies to regulate angiogenesis. In this study, we performed a CRISPR/Cas9 knockout screen targeting cell membrane proteins in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) to discover new target genes for therapeutic antibodies affecting the proliferation of endothelial cells (ECs). We identified six candidate target genes for therapeutic antibody drugs: ADAM15, CXorf66, DCBLD1, TMEM204, TSPAN10, and VSTM5. Of these genes, TSPAN10 was selected as the most potential target gene by examining the ability of cell proliferation and migration in each knockout (KO) cell line of candidate genes. RNA-seq analysis also showed that genes involved with angiogenesis and Notch signaling are downregulated, but genes inhibiting cell cycle are upregulated in TSPAN10 KO cells compared to wild-type cells. Together, these findings suggest TSPAN10 is a potential anti-angiogenic target gene for therapeutic antibody drugs.
Table Of Contents
Ⅰ. Introduction 1
1.1 Angiogenesis 1
1.2 Anti-angiogenic therapy and its limitation 2
Ⅱ. Materials and Methods 5
2.1 Cell Culture 5
2.2 Transfection 5
2.3 Lentivirus production 5
2.4 CRISPR/Cas9 Screening 5
2.5 Generation of Knockout (KO) cell lines 6
2.6 Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) sequencing 6
2.7 Cell Proliferation assay 7
2.8 In-vitro cell migration (Wound Healing assay) 7
2.9 Capillary like tube formation assay 7
2.10 Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 8
2.11 Western Blot 8
2.12 RNA-seq 9
2.13 Statistic Analysis 9
Ⅲ. Results 11
3.1CRISPR library screening identifies the six potential genes for therapeutic antibody drugs 11
3.2 Each knockout (KO) cell line of candidate genes except ADAM15 in both cell types is successfully generated 15
3.3 TSPAN10 is the most potential target gene among the six candidate genes 22
3.4 RNA-seq reveals an expression profile of Notch-related genes in TSPAN10 KO ECs 25
Ⅳ. Discussion 32
Ⅴ. References 34
Ⅵ. Summary in Korean(국문) 40
New Biology
Related Researcher
  • 예경무 Yea, Kyungmoo 뉴바이올로지학과
  • Research Interests Antibody; Engineering; Phage Display; Therapeutics; Immune; Exosome; Translational; Cytokine
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