Caenorhabditis elegans avoids epigallocatechin gallate (EGCG) through the SRXA-7 G-protein coupled receptor and the BBS-2 BBSome

Abstract

Flavonoids are plant-derived polyphenols that influence nematode behavior, yet their neuronal and molecular targets remain poorly defined. Here, I show that the free-living nematode Caenorhabditis elegans detects and avoids the green tea catechin epigallocatechin gallate (EGCG) through the SRXA-7 G-protein-coupled receptor (GPCR) in the ASH nociceptive neurons. Among green tea catechins, only EGCG and epicatechin gallate (ECG), which contain a galloyl moiety, elicit robust avoidance behavior. This response exhibits species- and strain-specific variation and is dynamically modulated by prior experience and nutritional state. I next find that the ASH chemosensory neurons are required for EGCG detection, and that avoidance is mediated by canonical GPCR signaling components including GRK-2, GPA-3, ODR-3, and the TRPV channels OCR-2 and OSM-9. A targeted GPCR screen identifies srxa-7 mutants with selective defects in EGCG avoidance. Calcium imaging reveals reduced EGCG-evoked responses in the ASH neurons of srxa-7 mutants, which I restore by ASH-specific expression of srxa-7 cDNA, indicating that SRXA-7 and its signaling pathway mediate EGCG avoidance. I further identify bbs-2, a gene encoding a Bardet-Biedl Syndrome (BBS) protein essential for ciliogenesis, as a key component of the avoidance circuit. A non-biased mutant screen reveals that srh-10 GPCR mutants harbor a second-site mutation in bbs-2, which abolishes EGCG avoidance. Whole-genome sequencing and genetic mapping confirm bbs-2 as the causative mutation, and ASH-specific expression of bbs-2 gDNA fully rescues the behavioral phenotype. While bbs-2 mutants fail to exhibit avoidance behavior and dye uptake, they retain robust EGCG-evoked calcium transients in the ASH neurons, indicating intact sensory detection but impaired behavioral output. To investigate signal transmission downstream, I conduct calcium imaging in the AVA interneurons and found abolished calcium transients upon EGCG exposure in bbs-2 mutants. These results demonstrate that BBS-2 functions within the ASH neurons to facilitate signal transduction from sensory detection to downstream neural circuits. Together, these findings identify SRXA-7 as a sensory receptor for galloylated polyphenols in the ASH neurons and demonstrate that BBS-2 is essential for coupling chemosensory input to avoidance behavior. By uncovering how specific sensory receptors and ciliary components jointly drive aversive responses, this work provides mechanistic insight into the neural and molecular basis of adaptive behavioral avoidance of dietary polyphenols in nematodes.

Keywords: Plant-nematode interaction, SRXA-7, GPCR, BBS-2, BBSome, C. elegans|다양한 종이 어우러져 균형을 이루는 자연 생태계에서 생물들은 복잡한 그물망처럼 상호작용하며, 긍정적 혹은 부정적 영향을 끊임없이 주고받으며 살아간다. 서로 다른 커다란 계인 동물계와 식물계 사이에서도 여러 형태의 상호작용들을 쉽게 관찰할 수 있다. 특히 미시세계에서 이러한 상호작용은 더욱 치열하게 나타나는데, 땅 아래에서 일어나는 식물-선충 상호작용(plant-nematode interaction)은 식물과 동물이 오랜 기간 경쟁적으로 발전시켜온 전략을 잘 보여준다. 움직일 수 없는 식물들은 주변 선충으로부터 자신을 보호하고 이득을 얻기 위해 다양한 식물 유래 화합물(plant-derived com-pounds)을 합성하고 분비한다. 그 중 플라보노이드(flavonoids)는 식물-선충 상호작용에서 주요한 플레이어로 작용한다. 선충의 생리와 행동을 종 특이적으로 조절함으로써 해로운 선충을 방어하고 유익한 자원을 획득한다. 화학감각이 잘 발달된 선충은 다양한 식물 유래 화합물을 감지하여 끌림 또는 회피 반응을 통해 식물에서 유용한 자원을 얻거나 잠재적 위협을 피하는 등 민감하게 대응한다. 플라보노이드가 동물의 생리와 행동에 중요한 영향을 미치는 것은 분명하지만, 동물이 이를 감지하고 처리하여 적절한 행동 반응으로 연결하는 신경생리학적 기작에 대한 이해는 깊지 않다.

예쁜꼬마선충은 플라보노이드의 주요 타겟인 식물 기생 선충(plant-parasitic nematode)과 구조적·기능적으로 유사한 화학감각계(chemosensory system)를 가지고 있어, 플라보노이드에 의한 행동반응과 그 기저의 신경생리학적 기작을 연구하는데 이상적인 모델 동물이다. 첫째, 통제된 환경에서 선충 행동반응을 신속·정확하게 분석할 수 있어, 선충의 행동반응을 유도하는 플라보노이드의 종류와 농도를 특정하고, 그에 따른 반응강도, 반응시간 그리고 반응거리 등의 행동적 특징을 상세히 밝혀낼 수 있다. 둘째, 302개의 뉴런으로 구성된 단순한 신경계와 13쌍의 구분된 기능을 가진 화학 감각 뉴런(chemosensory neuron)을 통해 플라보노이드를 감지하는 뉴런을 특정하고 칼슘이미징으로 자극에 대한 신경반응을 관찰하여 그 특질을 파악하는데 용이하다. 셋째, 1300 여개의 G단백질 결합 화학감각 수용체 후보 유전자와 발달된 유전학적 도구를 이용한 유전자 조작 및 분석을 통하여 선충의 행동반응을 이끌어내는 수용체를 발굴하기 매우 용이하다.

본 연구자는 선충에서 생리활성을 보이는 다양한 플라보노이드들로 행동반응 스크리닝하여, 녹차잎 유래 카테킨 (catechin)인 epigallocatechin gallate(EGCG)가 예쁜꼬마선충의 회피행동을 유도함을 발견했다. 먼저 예쁜꼬마선충의 회피반응을 이끌어내는 EGCG의 특징을 알아보기 위해 유사한 구조의 화학물질로 실험을 했다. 녹차잎 유래 카테킨 중 갈로일 그룹(galloyl group)을 함유한 EGCG와 ECG(epicatechin gallate)만이 선충의 회피행동을 유도했고, 다른 갈로일화 폴리페놀(galloylated polyphenol) 역시 같은 반응을 일으키는 것을 보아, EGCG의 갈로일 그룹이 예쁜꼬마선충의 회피반응을 유발하는 구조적 특징임을 확인했다. 두번째로 예쁜꼬마선충의 EGCG 회피반응의 특징을 알아보기 위해 두가지 행동가소성 실험을 하였다. 선충의 EGCG 선행노출에서 EGCG 농도가 짙어지고, 노출시간이 길어지면 추후 EGCG회피반응이 더욱 억제되는 것을 확인하였다. 반대로 선충의 섭식상태에서 굶주린 시간이 늘어남에 따라 회피하는 시간이 짧아지고 회피하는 거리가 늘어나는 것을 확인했다. 따라서 예쁜꼬마선충의 EGCG 회피반응은 선행노출과 섭식상태에 따라 유연하고 적응적으로 나타나는 것을 확인했다. 세번째로 EGCG를 회피하는데 필요한 예쁜꼬마선충의 신경분자적 기작을 알아보았다. 행동실험과 칼슘이미징을 통해 선충이 주요 통각 뉴런인 ASH뉴런으로 EGCG를 감각하고 회피반응을 한다는 것을 확인했다. 더불어ASH 칼슘이미징을 통해 선행노출과 섭식상태에 따른 EGCG 회피행동의 행동가소성이 감각뉴런 수준에서 형성되는 것을 확인했다. 다음으로 EGCG 회피행동이 ASH 뉴런 내에서 키나아제(kinase)인 GRK-2, G단백질 메신저인 GPA-3와 ODR-3, 그리고 TRPV 채널인 OCR-2와 OSM-9으로 구성된 GPCR 신호전달경로(signal transduction pathway)를 필요로 한다는 것도 확인했다. 마지막으로 ASH 뉴런에서 발현하는 GPCR을 스크리닝하여 SRXA-7이 EGCG를 포함한 갈로일 그룹 특이적으로 작용하는 G 단백질 결합 수용체인 것을 발굴했다.

마지막으로 GPCR 스크리닝 과정에서 EGCG 회피결함을 보이는 미상의 돌연변이를 유전자 분석한 결과, 섬모형 뉴런(ciliated neuron)의 섬모를 형성하고 유지하는데 주요한 역할을 하는 섬모내 수송(Intraflagellar transport) 복합체 단백질 중 BBS-2 단백질을 암호화하는 유전자에 문제가 생기면 EGCG 회피반응 결함을 유발하는 것을 발견했다. 추가적으로bbs-2 돌연변이에서 다른 뉴런에서의 결함을 확인했을 때, 감각뉴런-화학물질에 따라 선택적으로 관여하는 것을 확인했다. 특히 bbs-2 돌연변이는 ASH-감지 화학물질 중에서도, EGCG에 특이적으로 회피행동이 사라지는 것을 확인했고, 해당 결함은 ASH 뉴런 특이적으로 bbs-2 gDNA를 재도입 해주었을 때 정상 수준으로 회복되었다. 염료 충전 분석(Dye filling assay)을 통해 bbs-2 돌연변이의 섬모성 뉴런들이 섬모 첨단의 형상변화로 염색이 되지 않는 것을 확인했다. 하지만 EGCG 회피반응과 섬모의 염색과에 결함이 생긴 것과 달리 bbs-2 돌연변이의 ASH 뉴런은 EGCG 노출에 따른 정상적인 칼슘유입이 확인했다. 반대로 ASH 하위뉴런이자 해당 회피회로의 명령 개재 뉴런인 AVA 뉴런의 EGCG 노출에 대한 칼슘 유입은 거의 사라진 것을 확인했다. 따라서 섬모내 수송에 필요한 BBS-2단백질은 ASH뉴런-EGCG 특이적으로 행동반응 촉발에 필요한 ASH 뉴런내 신호전달에 주요한 역할을 하는 것을 발견하였다.

이 연구에서 예쁜꼬마선충이 ASH 감각 뉴런의 SRXA-7 G단백질 수용체를 통해 EGCG를 감지하고 해당 뉴런의 신호전달경로와 회피회로의 하위 뉴런으로 자극을 전달하여 회피반응을 촉발하는 것을 밝혔다. 또한 회피행동을 이끌어내는 EGCG의 특징과 이 회피행동이 가지는 다양성과 유연성 그리고 행동반응 기저의 분자적 기작과 신경세포와 회로의 특질을 밝혔다. 이를 통해 식물이 합성한 화합물이 어떻게 동물의 신경계에 영향을 미치고 행동을 조절하는지에 대한 분자적 신경생리학적 기작을 제시하였다. 또한 BBS-2 단백질이 EGCG 특이적으로 ASH 뉴런 내의 감각신호전달에 관여하는 것을 밝혔다. 이를 통해 BBS 단백질이 단순히 섬모내 수송 기능을 넘어 감각뉴런-화학물질 특이적으로 신호전달에 기여하는 새로운 가능성을 제시하였다. 종합적으로 이 연구는 식물-선충 상호작용에서 식물 화합물이 동물의 신경계를 통해 처리되고 적응적 행동으로 출력되는 과정을 신경생리학적 수준에서 이해하는데 중요한 통찰을 제공한다. 이를 통해 식물 화합물과 동물 행동 사이의 연결고리를 분자 수준에서 규명함으로써 생태학, 신경생물학, 약리학 분야에 중요한 단초가 될 것으로 기대한다.

핵심어: 식물-선충 상호작용, 화학감각, SRXA-7, BBS-2, 예쁜꼬마선충