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Neuroprotective effects of HDAC6 and Vitamin B₁₂ in TDP-43 proteinopathies

Neuroprotective effects of HDAC6 and Vitamin B₁₂ in TDP-43 proteinopathies
Younghwi KWON
DGIST Authors
Younghwi KWONSung Bae LeeHyung-Jun Kim
Hyung-Jun Kim
Issued Date
Awarded Date
TDP-43, HDAC6, Vitamin B12
TDP-43, HDAC6, Vitamin B12
연구에서 우리는 TDP-43유도 독성을 억제하는 인자를 발굴하려고 했다. TDP-43에 의해 유도되는 병리학적 장애는 ALS, FTLD, AD와 같은 퇴행성뇌질환을 유도한다. 세포 내에 TDP-43의 응집은 단백질품질조절 장애, ER 스트레스 및 미토콘드리아의 장애와 같은 병리학적 장애를 유발한다. 이러한 병리학적 변화는 신경세포 사멸을 유도한다. 따라서, 단백질품질조절 장애 또는 ER 스트레스를 억제하는 인자들이 TDP-43 독성을 감소시킬 수 있다.
응집된 TDP-43-의 제거는 TDP-43 단백병증의 치료방법 중 하나이다. TDP-43의 과발현은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (Ubiquitin proteasome system, UPS) 장애 및 유비퀴틴화된 단백질들의 축적을 유도한다. 프로테아좀이 손상되었을 때, 자가포식-리소좀 경로 (Autophagy-lysosomal pathway, ALP) 가 활성된다. HDAC6는 UPS와 ALP를 조절하는 인자 중 하나이다. 또한 이전연구에서 HDAC6가 프로테아좀 손상에 의한 독성을 완화시킨다고 알려져 있다. HDAC6는 ubiquitin-binding domain을 통하여 유비퀴틴화된 단백질과 결합하고, HDAC6-유비퀴틴 단백질의 복합체는 ALP를 통하여 제거된다. 첫번째 파트에서 우리는 HDAC6의 과발현이 TDP-43-과발현 세포에서 TDP-43의 응집을 감소시킨다는 것을 확인하였다. HDAC6는 자가포식-리소좀 경로 (autophagy-lysosomal pathway, ALP)를 통해 TDP-43에 의해 유도되는 UPS 손상을 조절한다. 또한, HDAC6가 과발현 된 초파리에서 TDP-43에 의해 유도된 짧은 수명, 운동능력의 결함이 개선되었고 TDP-43에 의해 축적된 유비퀴틴 응집체가 감소하였다. 비정상적인 단백질 축적은 ER stress를 유도한다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서 TDP-43에 의한 단백질품질조절 장애는 ER stress를 유도할 수 있다. ER stress와 미토콘드리아의 기능장애는 TDP-43의 단백병증에서 나타나는 특징으로 알려져 있다. ER은 비정상적인 단백질의 접힘을 담당하고, 비정상적인 단백질의 축적은 ER stress를 유도한다고 알려져 있다. 많은 논문에서 ER stress는 퇴행성뇌질환에 중요하다고 알려져 있다. eIF2α의 인산화는 ER stress에 중요한 인자로 알려져 있다. 이전연구에서 TDP-43의 과발현이 eIF2α 인산화를 증가시키고, TDP-43의 독성이 eIF2α 인산화 억제를 통하여 감소될 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다. TDP-43 단백병증에서 상당한 양의 TDP-43가 미토콘드리아에 축적된다. 미토콘드리에서의 TDP-43 축적은 ROS 생성 및 미토콘드리아 막전위가 감소를 유도한다. TDP-43가 미토콘드리아로 축적되는 것을 막으면 TDP-43에 의한 병리학적 변화를 억제할 수 있다. 이 연구에서는 vitamin B12가 TDP-43에 의한 신경독성을 감소시킨다는 것을 확인하였다. Vitamin B12의 처리는 TDP-43에 의해 유도되는 ER stress를 감소시켰다. 또한 vitamin B12의 처리는 TDP-43가 유도하는 미토콘드리아의 장애를 감소시켰다. Vitamin B12가 TDP-43 응집에 영향을 미치지 않지만 Vitamin B12는 ER 스트레스와 미토콘드리아의 기능장애의 감소를 통해 TDP-43의 독성을 완화시킨다.
종합적으로, HDAC6와 Vitamin B12가 서로 다른 분자기전을 통하여 TDP-43의 독성을 억제시키는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해서 우리는 HDAC6와 Vitamin B12의 공동 처리가 TDP-43 단백병증에 효과적인 치료전략이 될 것이라고 사료된다| TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43) is encoded by human TARDBP gene, highly conserved member of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) family. TDP-43 regulates RNA metabolism like transcription, splicing, translation, and stability of RNA. Accumulation of TDP-43 involved in several neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal lobar dementia (FTLD). In diseases condition, TDP-43 forms aggregates in cytoplasm of neuron and glia. Cytoplasmic accumulation of TDP-43 triggers many pathological features including dysfunction of protein quality control (ubiquitin-proteasome system and autophagy), ER stress, and mitochondrial dysfunction. Several research indicated that reducing of TDP-43 toxicity might be therapeutic approach in many neurodegenerative diseases associated with TDP-43 pathology.
In first chapter, we focused on TDP-43-induced ubiquitin-proteasome system (UPS) impairment. It is already known that cytoplasmic accumulation of TDP-43 induces UPS im-pairment. Histone deacetylase 6 (HDAC6) is cytosolic deacetylase enzyme that suppresses the toxicity of UPS impairment. However, the role of HDAC6 in TDP-43-induced neurotoxicity is largely unknown. In this chapter, we showed that overexpression of HDAC6 reduced the cytoplasmic TDP-43 protein level in TDP-43-overexpressing neuronal cells. Moreover, HDAC6 regulates TDP-43-induced UPS impairment via autophagy-lysosome pathway (ALP). Also, we showed that TDP-43-induced short life span, accumulated ubiquitin aggregates and defected climbing ability were rescued by overexpression of HDAC6 in Drosophila model.
In second chapter, we focused on TDP-43-induced ER stress and dysfunction of mi-tochondria. Several research indicated that cytoplasmic accumulation of TDP-43 induces ER stress and mitochondrial dysfunction. In this chapter, we showed that vitamin B12 treatment rescued TDP-43-induced neurotoxicity. Although vitamin B12 did not affect the cytoplasmic accumulation of TDP-43, Vitamin B12 reduced TDP-43-induced toxicity through reduction of ER stress and mitochondrial dysfunction. Overexpression of TDP-43 induces eIF2α phosphorylation. We found that Vitamin B12 treatment reduces TDP-43-induced eIF2α phosphorylation. Also, vitamin B12 modulates TDP-43-induced mitochondrial dysfunction via cGAS/STING pathway. Moreover, vitamin B12 rescued TDP-43-induced short life span and climbing defect in Drosophila model.
Overall, we discussed about TDP-43-induced neurotoxicity through pathological fea-tures of TDP-43. HDAC6 regulates TDP-43-induced UPS impairment and neuronal toxicity and treatment of vitamin B12 moderates TDP-43-induced ER stress and mitochondrial dys-function. Based on these data, we suggest that HDAC6 and Vitamin B12 treatment could be therapeutic approaches in TDP-43 proteinopathies.
Table Of Contents
Ⅰ. Introduction 1
Ⅱ. PART1. The role of HDAC6 in TDP-43-induced neurotoxicity 5
2.1 Introduction 6
2.2. Material and Method 8
2.2.1 Reagents and Antibodies 8
2.2.2 Cell Culture 8
2.2.3 Transfection 8
2.2.4 Stable transfection 9
2.2.5 Immunoblot analysis 9
2.2.6 Preparation of soluble and insoluble cell extracts 9
2.2.7 Nuclear and Cytoplasmic extraction 9
2.2.8 Quantitative RT-PCR 10
2.2.9 Immunostaining 10
2.2.10 Mitochondrial activity assay 11
2.2.11 Fly strains 11
2.2.12 Climbing and Lifespan assay 11
2.2.13 Statistical analyses 12
2.3 Results 13
2.3.1 Overexpression of HDAC6 reduces TDP-43 protein level 13
2.3.2 HDAC6 regulates the aggregation and mislocalization of TDP-43 16
2.3.3 Knockdown of HDAC6 enhances TDP-43 proteinopathies 20
2.3.4 Inhibition of HDAC6 deacetylase activity does not affect TDP-43 protein levels 23
2.3.5 HDAC6 mitigates TDP-43-induced ubiquitin-proteasome system (UPS) impairment 26
2.3.6 HDAC6 mitigates TDP-43-induced UPS impairment via autophagy-lysosomal pathway (ALP) 30
2.3.7 HDAC6 attenuates TDP-43-induced mitochondrial dysfunction and neurotoxicity 33
2.3.8 Overexpression of HDAC6 rescues behavioral deficits and UPS impairment in Drosophila model of TDP-43 proteinopathies 36
2.4 Discussion 39
Ⅲ. PART2. Protective effects of Vitamin B12 on TDP-43-induced neurotoxicity 41
3.1 Introduction 42
3.2 Material and Method 44
3.2.1 Reagents and Antibodies 44
3.2.2 Cell culture 44
3.2.3 Lentiviral Transduction 44
3.2.4 Cytotoxicity Assay 44
3.2.5 Flow Cytometry analysis of Annexin Ⅴ-FITC/PI staining 45
3.2.6 Immunoblot analysis 45
3.2.7 Preparation of soluble and insoluble cell extracts 45
3.2.8 Nuclear and Cytoplasmic extraction 46
3.2.9 Mitochondrial extraction 46
3.2.10 Immunostaining 46
3.2.11 InCucyte ZoomTM (IncucyteTM Cytotox Red Reagents to Detect Dead Cell) 46
3.2.12 Mitochondrial activity assay 47
3.2.13 Quantitative RT-PCR 47
3.2.14 Subcellular fractionation and DNA isolation 47
3.2.15 Fly Strains 48
3.2.16 Climbing and Lifespan analysis 48
3.2.17 Statistical analyses 48
3.3 Results 49
3.3.1 Vitamin B12 mitigates TDP-43-induced neurotoxicity 49
3.3.2 Vitamin B12 does not influence on TDP-43 protein levels 52
3.3.3 Vitamin B12 suppresses TDP-43-induced ER stress 55
3.3.4 Vitamin B12 ameliorates TDP-43-induced mitochondrial dysfunction 58
3.3.5 Vitamin B12 regulates TDP-43-induced mitochondrial unfolded protein response (mtUPR) and mitochondrial DNA (mtDNA) release 62
3.3.6 Vitamin B12 mitigates TDP-43-induced neurotoxicity in Drosophila TDP-43 proteinopathies model 66
3.4 Discussion 70
Ⅳ. Conclusion 73
Ⅴ. Reference 76
Abstract in Korean 88
Department of Brain Sciences
Related Researcher
  • 이성배 Lee, Sung Bae 뇌과학과
  • Research Interests Cellular mechanism of neurodegenerative diseases; Neuronal maintenance and remodeling; 퇴행성 뇌질환의 세포기전; 신경계 유지 및 리모델링 연구
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