Inferring Kinetic Model for Regulating EGFR Dimerization via the Single-Molecule and the Ensemble Assay

Abstract

The interaction of membrane proteins can activate downstream signaling pathways which can induce cellular processes. However, over-expression of the proteins, which can induce continuous activation of these processes, can be a cause of diseases. Therefore, the relational equation between the interaction dynamics and expression level of membrane proteins is essential for understanding this molecular mechanism. According to this importance, we tried to propose an analytical model to describe the dimerization of EGFR which is known as the diagnostic marker of cancer cells. In this paper, we utilized single-molecule tracking (SMT) to directly monitor the real-time diffusivity of EGFR and analyzed the trajectories using hidden Markov model (HMM) analysis to obtain the kinetic information of state transitions. However, for inferring the dimerization of EGFR, it was necessary to consider the molecular events including generation and internalization occurred in the cellular environment. To obtain additional quantitative information, we measured the monomeric and dimeric fractions of EGFR through western immunoblotting. Therefore, we proposed and validated a non-equilibrium steady state model of EGFR using these two measurements.

본 논문에서는 살아있는 세포에서 막단백질의 발현량과 그들의 이량체화를 조절하는 요인들 사이의 상관관계를 운동학적 관점에서 설명한다. 막단백질의 상호작용은 자가인산화를 통한 신호 전달을 개시함으로써 생존 및 사멸을 포함한 세포 과정에 관여한다. 하지만 특정 막단백질의 과발현은 이러한 세포 과정을 과도하게 유도하여 다양한 질병의 원인이 된다. 이러한 이유로 막단백질의 발현량과 상호작용 사이의 관계를 규명하는 것은 매우 중요하다. 따라서 우리는 암세포의 진단 마커로 알려진 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 운동학적 모델을 제시하는 것을 목표로 하였다. 우리는 발현량에 따라 나타나는 EGFR의 결합율과 해리율을 분석하기 위해 이들을 실시간으로 직접 관찰할 수 있는 단일 입자 추적을 활용하였다. 하지만 EGFR의 운동학적 모델을 제시하기 위해서, 세포막을 중심으로 한 막단백질의 생성 및 소멸의 고려가 필요했다. 추가적인 정량적 정보를 획득하기 위해서 EGFR의 상태 분율 정보를 위한 웨스턴 블롯을 활용하였다. 우리는 이 두 가지 결과를 결합하여 관찰하기 어려운 생성 및 소멸을 운동학적 모델을 통해 설명하였다. 이 결과는 EGFR의 활동 양상이 비평형 정상 상태로 설명 가능함을 시사한다.